Патент на изобретение №2287164

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗА ТЕЧЕНИЯ РЕВМАТОИДНОГО УВЕИТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии. Сущность способа: у пациентов с ревматоидным увеитом в острый период заболевания, а именно в период с 7 по 10 день, в сыворотке крови определяют концентрацию фактора некроза опухоли (ФНО-). При его содержании 150 пкг/мл и выше течение ревматоидного увеита прогнозируют как благоприятное, а при концентрации в интервале от 50 до 100 пкг/мл – как неблагоприятное. Применение способа повышает точность прогнозирования тяжести клинического течения ревматоидного увеита, дает возможность проведения адекватной медикаментозной терапии.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”Автореф. дисс. к.м.н. Санкт-Петербург, 1998, с.16-21. PEREZ-GOIJO V. et al. Tumour necrosis factor-alpha levels in aqueous humour and serum from patients with uveitis: the involvement ofHLA-B27. Curr. Med. Res. Opin. 2004, 20(2), p.155-157, реф. PMID 15006008, [он-лайн], [найдено 15.02.2006]. Найдено из БД PubMed.

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано в медицинской практике для прогноза течения ревматоидного увеита (РУ).

Способы прогноза течения РУ основаны на изучении при этом заболевании иммунопатологических изменений, сопровождающихся нарушениями числа и спектра субпопуляций лимфоцитов крови, изменениями уровня аутоантител к иммуноглобулину G, неденатурированной ДНК (В.И.Мазурова. Клиническая ревматология, 2001, с.52-54) и локального цитокинового статуса (Л.Е.Теплинская с соавт. Воспалительные заболевания органа зрения, Челябинск, 2004, с.9-11).

О характере течения увеитов и прогнозе их исходов судят по функциональной активности клеток крови, выявляемой по уровню синтеза ими цитокинов, одним из которых является фактор некроза опухоли (ФНО-). Данный цитокин определяет острую фазу воспаления и влияет на индукцию аутоиммунных реакций.

Наиболее близкой по технической сущности является статья О.С.Слеповой с соавт.«Сравнительное исследование роли цитокинов при разных формах глазных заболеваний. Сообщение 1. Фактор некроза опухоли альфа» (О.С.Слепова с соавт., Вестник офтальмологии, 1998, №3, с.28-32), где изложена возможность прогнозирования течения эндогенных увеитов при одновременном определении содержания ФНО- в сыворотке крови и слезной жидкости.

Недостатком данного способа является одновременный забор 2 образцов (и сыворотки крови и слезной жидкости) для исследования, необходимость проведения расчетов соотношения концентраций цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости, что требует дополнительного времени, кроме этого, требуется увеличение расхода дорогостоящих реактивов.

Техническим результатом изобретения является повышение точности и сокращение времени прогноза течения РУ.

Технический результат достигается способом прогноза, заключающегося в определении концентрации фактора некроза опухоли альфа в острый период заболевания в сыворотке крови, отличающийся тем, что фактор некроза опухоли альфа определяют в сыворотке крови с 7 по 10 день от начала заболевания, когда отмечают более значимое накопление данного цитокина в сыворотке крови, и при его содержании 150 пкг/мл и выше течение ревматоидного увеита оценивают как благоприятное, а при концентрации в интервале от 50 до 100 пкг/мл – как неблагоприятное.

Преимуществом предлагаемого способа прогноза течения РУ является однократное определение содержания ФНО- только в сыворотке крови в острый период на 7-10 день заболевания, экономия, более чем в 2 раза, времени на заготовку исследуемых образцов (отсутствие необходимости сбора слезной жидкости) и расхода дорогостоящих реактивов. Подтверждением предлагаемого способа прогноза является совпадение показателей концентрации исследуемого цитокина в сыворотке крови с прогнозируемым клиническим течением РУ в 85,7% случаев.

Способ осуществляют следующим образом.

Взятие крови без антикоагулянта для получения сыворотки осуществляют натощак из локтевой вены обследуемых в строго стерильных условиях.

Определение уровня провоспалительного ФНО- в сыворотке крови больных проводят твердофазным иммуноферментным методом с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента с использованием тест-систем ProCon (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург).

В микропланшет с иммобилизованными антителами вносят по 100 мкл стандартов ФНО- и по 100 мкл исследуемых образцов сыворотки крови. Планшет инкубируют 1 час при +37°С при непрерывном встряхивании, затем трижды промывают буфером и дважды дистиллированной водой. Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

В каждую ячейку микропланшета вносят по 100 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена, разведенного буфером. Планшет инкубируют в течение 30 мин при +20 – +25°С при непрерывном встряхивании. Жидкость из ячеек удаляют и трижды промывают буфером, затем дважды дистиллированной водой. Планшет сушат путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.

Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора субстрата с красителем. Микропланшет инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре в защищенном от прямых лучей месте на шейкере. Наблюдается развитие голубой окраски. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл серной кислоты в каждую лунку. Общее время постановки исследования 2,5-3 часа.

Учет результатов проводят с использованием автоматического фотометра «Multiscan» при длине волны 450 нм, устанавливают нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Результаты выражают в пкг/мл. Нормальный уровень исследуемых цитокинов в сыворотке крови у практически здоровых лиц (контрольная группа), как правило, не превышает 50 пкг/мл.

У 28 больных РУ было изучено содержание провоспалительного цитокина ФНО- в сыворотке крови в острый период заболевания. Взятие крови без антикоагулянта для получения сыворотки осуществляли натощак из локтевой вены обследуемых в строго стерильных условиях.

Определение уровня ФНО- в сыворотке крови больных проводят твердофазным иммуноферментным методом с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента.

В микропланшет с иммобилизованными антителами вносят по 100 мкл стандартов ФНО- и по 100 мкл исследуемых образцов сыворотки крови больных. Планшет инкубируют 1 час при +37°С при непрерывном встряхивании, затем трижды промывают буфером и дважды дистиллированной водой. Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

В каждую ячейку микропланшета вносят по 100 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена, разведенного буфером. Планшет инкубируют в течение 30 минут при +20 – +25°С при непрерывном встряхивании. Жидкость из ячеек удаляют и трижды промывают буфером, затем дважды дистиллированной водой. Планшет сушат путем постукивания по поверхности лабораторного стола, покрытого фильтровальной бумагой.

Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора субстрата с красителем. Микропланшет инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре в защищенном от прямых лучей месте на шейкере. Наблюдают развитие голубой окраски. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл серной кислоты в каждую лунку.

Учет результатов проводят с использованием автоматического фотометра «Multiscan» при длине волны 450 нм, устанавливая нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Результаты выражают в пкг/мл.

У 22 (78,6%) из 28 больных РУ содержание ФНО- в сыворотке крови на 7-10 день от начала заболевания было выявлено в пределах от 150 пкг/мл и выше. При этом у 20 (90,9%) из них клинически заболевание протекало благоприятно, и к концу 2-ой недели воспалительный процесс был купирован. У 2 (9,1%) больных течение увеита характеризовалось как неблагоприятное, т.к. в течение 2-х недель сохранялась воспалительная реакция с перикорнеальной инъекцией и преципитатами. Лишь к концу 3-ей недели было отмечено стихание воспалительного процесса в глазу.

У 6 (21,4%) из 28 больных РУ концентрация ФНО- в сыворотке крови в этот же период заболевания составляла от 50 до 100 пкг/мл. При этом неблагоприятное течение РУ наблюдали у 4 (66,7%) пациентов. Несмотря на проводимую противовоспалительную терапию, происходило дальнейшее снижение остроты зрения, усиление перикорнеальной инъекции, появились свежие преципитаты на эндотелии роговицы и задние синехии, неоваскуляризация радужки. У 2 (33,3%) больных заболевание протекало благоприятно с купированием воспалительного процесса и хорошими визуальными результатами к концу второй недели лечения.

Таким образом, предлагаемый способ прогноза течения РУ являлся правильным у 24 из 28 больных, что было достоверно в 85,7% случаев. Кроме того, постановка реакции, проводимая с одним видом образца – кровью, сокращала в 2 раза расход реактивов, а также сбор и подготовку исследуемого образца больше, чем в 2 раза, что в итоге позволяло сократить время прогноза течения увеита более, чем в 2 раза.

Пример 1. Больная X. Находилась на стационарном лечении по поводу ревматоидного увеита. Определение цитокинов в сыворотке крови проводилось по вышеописанной методике. В разгар заболевания на 8 сутки содержание ФНО- в сыворотке крови было равно 59,7 пкг/мл, на основании чего прогнозировали неблагоприятное течение. Действительно, в динамике развития заболевания, несмотря на проводимое противовоспалительное лечение, было отмечено появление свежих преципитатов, новых спаек и увеличение клеточной взвеси во влаге передней камеры. Больная находилась на стационарном лечении более 3-х недель. Таким образом, низкое содержание ФНО- в сыворотке крови (59,7 пкг/мл) в острой стадии свидетельствует о неблагоприятном прогнозе течения РУ.

Пример 2. Больная С., 43 лет, находилась на стационарном лечении по поводу ревматоидного увеита. Определение цитокинов в сыворотке крови проводилось по вышеописанной методике. В разгар заболевания на 7 сутки содержание ФНО- в сыворотке крови было равно 56,2 пкг/мл, было предположено неблагоприятное течение увеита. Противовоспалительное лечение, проведенное больной в течение 20 дней, не улучшило клинической картины заболевания, сохранялись боли, низкая острота зрения, биомикроскопически выявлялись преципитаты и спайки, что подтверждало неблагоприятный прогноз течения РУ.

Пример 3. Больная Ф., 56 лет, поступила в отделение с диагнозом: рецидив хронического увеита ревматоидной этиологии. На 9 день от начала заболевания содержание ФНО- в сыворотке крови составило 91,4 пкг/мл, что предполагало неблагоприятный прогноз течения РУ. Несмотря на проводимое в течение 17 дней комплексное лечение, достигнуть положительного клинического эффекта не удалось, что явилось подтверждением неблагоприятного прогноза течения РУ.

Таким образом, низкое содержание ФНО- в сыворотке крови (50-100 пкг/мл) в острой стадии свидетельствует о неблагоприятном прогнозе течения РУ.

Пример 4. Больная О. Диагноз: РУ. Определение цитокинов в сыворотке крови проводилось по вышеописанной методике. На 7 день от начала заболевания содержание ФНО- в сыворотке крови – 178,5 пкг/мл на основании установленного в пределах вышеуказанного интервала (интервала (150 пкг/мл и выше) значения ФНО- в сыворотке крови больной прогнозировали благоприятное течение ревматоидного увеита. Стихание воспалительного процесса, исчезновение перикорнеальной инъекции и частичное рассасывание преципитатов на эндотелии роговицы, отмечали уже к 13-14 суткам после начала заболевания, что подтверждало ранее предположенный благоприятный прогноз течения РУ.

Пример 5. Больная С., 62 года. Диагноз: РУ. На 7 день от начала заболевания содержание ФНО- в сыворотке крови – 1165,5 пкг/мл. На основании установленного в пределах вышеуказанного интервала (150 пкг/мл и выше) значения ФНО- в сыворотке крови больной прогнозировали благоприятное течение ревматоидного увеита. Стихание воспалительного процесса, исчезновение перикорнеальной инъекции и частичное рассасывание преципитатов на эндотелии роговицы, отмечали уже на 12 день после начала заболевания, что подтверждало предположенный нами благоприятный прогноз.

Пример 6. Больная М., 48 лет. Диагноз при поступлении: острый ревматоидный увеит. Содержание ФНО- в сыворотке крови пациентки на 7 день от начала заболевания было равно 1173,7 пкг/мл, что предполагало благоприятное течение РУ. Действительно, уже на 10 день заболевания в ходе лечения появилась положительная динамика: исчезли боли, уменьшилась гиперемия конъюнктивы склеры, на роговице частично рассосались преципитаты, синехии разорвались. Улучшение клинической картины заболевания свидетельствовало о правильном прогнозе течения РУ.

Таким образом, предлагаемый способ прогноза течения ревматоидного увеита позволяет оценить характер течения этого заболевания в острой его стадии (в период с 7 по 10 день) по содержанию ФНО- в сыворотке крови пациентов. Прогноз течения РУ является благоприятным при уровне ФНО- в сыворотке крови пациентов 150 пкг/мл и выше с 7 по 10 день от начала заболевания и неблагоприятным – при его концентрации в интервале от 50 до 100 пкг/мл в этот же период.

Формула изобретения

Способ прогноза течения ревматоидного увеита путем определения концентрации фактора некроза опухоли в острый период заболевания в сыворотке крови, отличающийся тем, что фактор некроза опухоли определяют в сыворотке крови с 7 по 10 день от начала заболевания и при его содержании 150 пкг/мл и выше течение ревматоидного увеита оценивают как благоприятное, а при концентрации в интервале от 50 до 100 пкг/мл – как неблагоприятное.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 06.07.2007

Извещение опубликовано: 10.03.2009 БИ: 07/2009