Патент на изобретение №2287158

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ПО ГЕНЕТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ РИСКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и касается способа прогнозирования развития гипертонической болезни по генетическим факторам риска. Сущность изобретения заключается в выделении ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК амплификации фрагментов генов PON1 и СЕТР, в пределах которых локализованы полиморфные нуклеотидные замены, проведении анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ампликонов и при выявлении генотипов PON*BB и СЕТР*II прогнозируют риск развития гипертонической болезни. Преимущество изобретения заключается в повышении точности прогнозирования развития заболевания. 4 табл.

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования развития гипертонической болезни (ГБ).

ГБ является большой медико-социальной проблемой и тяжким бременем для здравоохранения. ГБ страдает до 20% взрослого населения мира, причем на протяжении нескольких последних десятилетий наблюдается дальнейший рост заболеваемости этой патологией. У больных ГБ велик риск развития таких тяжелых осложнений, как инфаркт миокарда и инсульт.

Вышеизложенное определяет необходимость разработки способов прогнозирования развития ГБ, что важно для оптимизации профилактики этого заболевания. Профилактику заболевания считают эффективным и экономичным направлением в медицине. Первичная профилактика предполагает формирование групп риска ГБ с использованием маркеров заболевания.

Применение разработанного способа обеспечит выявление лиц с высоким риском развития ГБ для того, чтобы осуществить мероприятия по профилактике развития данной патологии.

Профилактика ГБ имеет неоспоримые преимущества по сравнению с диагностикой на ранних стадиях развития этого заболевания.

Выявлено множество факторов риска развития ГБ. Их подразделяют на средовые и наследственно обусловленные (генетические факторы). Прогноз развития заболевания на основе анализа средовых факторов риска весьма затруднен вследствие того, что процесс сбора и интерпретации анамнестических сведений с целью выявления факторов риска является субъективным и определяется личностными особенностями обследуемого и уровнем профессионализма врача. Поэтому он не может быть достаточно объективным и точным. Очевидно, что генетические факторы риска, немодифицируемые на протяжении жизни человека, в большей мере соответствуют задачам составления прогноза риска заболевания.

Авторами в научно-медицинской и патентной литературе способы прогнозирования развития ГБ по генетическим факторам риска не обнаружены.

В свете современных знаний о многофакторной природе и роли наследственной компоненты в развитии ГБ, разработка способов прогнозирования развития этого заболевания путем типирования пациента по полиморфизмам генов риска является перспективным направлением для оптимизации профилактики самого заболевания еще в раннем возрасте, а также и для целевой профилактики поражений органов-мишеней.

Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного способа прогнозирования развития ГБ по генетическим факторам риска.

Технический результат при использовании изобретения – повышение точности прогноза. Указанный технический результат достигается тем, что проводят генотипирование индивида по полиморфизмам генов параоксоназы 1 (PON1) и белка-переносчика эфиров холестерина (СЕТР).

Для этого выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) амплифицируют фрагмент ДНК, полученный ампликон подвергают воздействию эндонуклеаз рестрикции, после чего проводят электрофорез в 7% полиакриламидном геле, окрашивают гель раствором бромистого этидия, фотографируют при ультрафиолетовом освещении и анализируют результаты электрофореза по числу и размерам рестрикционных фрагментов ДНК. Наличие фрагментов ДНК размером 99 нуклеотидных пар (н.п.) интерпретируют как аллель А, размером 65 н.п. и 34 н.п. – как аллель В гена PON1. Наличие фрагментов ДНК размером 120 н.п. и 76 н.п. интерпретируют как аллель V, размером 65 н.п. и 34 н.п. – как аллель I гена СЕТР.

При выявлении генотипов PON1*BB и СЕТР*II прогнозируют высокий риск развития ГБ у обследуемого.

Способ осуществляется следующим образом.

Получение фракции клеточных ядер осуществляется следующим образом.

1. Цельная венозная кровь (5 мл) в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляется 45 мл охлажденного лизирующего буфера (0.32 М сахароза; 5 мМ MgCl₂; 1% тритон Х-100; 10 мМ трис-HCl, рН 7.6).

2. Смесь инкубируется 5 мин во льду и центрифугируется при 2500 g и температуре 4°С 15 мин.

3. Надосадочная жидкость сливается, осадок ресуспендируется в 3 мл буфера (рН 8.0), содержащего 10-20 мМ трис-HCl, 2.5 мМ ЭДТА, 0.5% SDS и 100 мкг/мл протеиназы К.

4. Смесь инкубируется при температуре 56°С в течение 10-16 часов.

Из полученного лизата экстрагируется ДНК в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляется 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трис-HCl (рН 7.8).

2. Смесь центрифугируется при 1500 g в течение 10 мин.

3. Отбирается водная фаза, содержащая ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранная фаза обрабатывается смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем – только хлороформом.

5. ДНК осаждается двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК промывается 70% этанолом, подсушивается на воздухе и растворяется в 1,5 мл деионизированной воды; полученный раствор ДНК хранится при – 20°С.

Выход ДНК составляет 50-100 мкг на 1 мл образца крови.

В дальнейшем полученная ДНК используется в качестве матрицы для ПЦР, в результате которой амплифицируются нужные фрагменты в области экзона 6 гена PON1 и в области экзона 14 гена СЕТР.

Нуклеотидная замена, являющаяся причиной полиморфизма Gln192Arg в экзоне 6 гена PON1, выявляется рестрикцией полученного ПЦР-продукта ферментом AlwI. Нуклеотидная замена, лежащая в основе полиморфизма Val421Ile в экзоне 14 гена СЕТР, выявляется рестрикцией ПЦР-продукта ферментом FokI.

Состав реакционной смеси (25 мкл) для ПЦР следующий: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, по 250 мкМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dGTP, dCTP, dTTP, буфер для ПЦР (67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 mM MgCl₂, 16,6 mM (NH₄)₂SO₄ 0.01% Tween-20). Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°С, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°С – 20 секунд, 68°С – 25 секунд, 72°С – 30 секунд. После 30-го цикла проводят инкубацию при 72°С в течение 7 минут.

ПЦР-продукты подвергаются рестрикции и электрофорезу в вертикальном 7% полиакриламидном геле. Для этого 7 мкл ПЦР-продукта смешивается с 5 ед. фермента, смесь выдерживается при 37°С в течение 10 часов. Электрофорез проводится при постоянном напряжении 10 вольт/см в ТВЕ-буфере (0.089 М трис; 0.089 М борная кислота; 0.002 М ЭДТА, рН 8.0). Пробы, перед тем как нанести на гель, смешиваются в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0.25% бромфеноловый синий, 0.25% ксилен-цианол и 15% фикол. После окончания электрофореза для детекции результатов гель окрашивается раствором бромистого этидия в течение 10 минут, затем помещается на УФ-фильтр трансиллюминатора и фотографируется.

Размер и число фрагментов ДНК после рестрикции, фракционированных с помощью электрофореза, являются критериями для идентификации генотипа. В отношении полиморфизма гена PON1 наличие фрагмента ДНК размером 99 н.п. соответствует генотипу АА (гомозигота по отсутствию вариабельного сайта рестрикции), наличие фрагментов 99 н.п., 65 н.п. и 34 н.п. – генотипу АВ (гетерозигота по отсутствию и наличию сайта рестрикции), наличие фрагментов 65 н.п. и 34 н.п.- генотипу ВВ (гомозигота по наличию сайта рестрикции). В отношении полиморфизма гена СЕТР присутствие на электрофореграмме фрагментов ДНК размером 120 н.п.позволяет идентифицировать генотип W (гомозигота по отсутствию сайта рестрикции), фрагментов 120 н.п., 63 н.п. и 50 н.п. – генотип IV (гетерозигота), фрагментов 63 н.п. и 50 н.п. – генотипа II (гомозигота по наличию сайта рестрикции).

В качестве контроля обследовали группу здоровых мужчин, проживающих на территории республики Башкортостан (99 человек), у которых отсутствовали признаки сердечно-сосудистых заболеваний. В качестве конкретных примеров обследовано в целом 86 мужчин, больных ГБ, в возрасте от 25 до 65 лет, с длительностью заболевания более года. Средний возраст больных составил 46.37±10.45. Диагноз ГБ устанавливался на основании критериев Комитета экспертов ВОЗ (1997), обследование проводилось на базе Республиканского кардиологического диспансера города Уфы в отделении артериальной гипертензии. Контрольная группа и группа больных были сформированы из этнических татар, проживающих в Башкортостане.

Вычисление показателя относительного риска развития ГБ проводилось на основании расчета показателя соотношения шансов (odds ratio – OR), по формуле

OR=(a+0.5)(d+0.5)/(b+0.5)(c+0.5),

где а – частота генотипа в выборке больных;

b – частота генотипа в контрольной выборке;

с=1-а – сумма частот остальных генотипов в выборке больных;

d=1-b – сумма частот остальных генотипов в контрольной выборке.

Параметр 0.5 в представленной формуле используется в том случае, когда одно из чисел а, b, с, d равняется нулю или оказывается меньше трех. Высокий риск развития заболевания констатируют при OR>1.

Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфизма Gln192Arg в экзоне 6 гена PON1 и полиморфизма Val421Ile в экзоне 14 гена СЕТР представлены в табл.1, 2 и 3.

При сравнении группы больных ГБ и контрольной группы нашли, что различия между ними состоят в том, что в группе больных выше частота генотипа PON*BB (18.60% против 8.08%, Р=0.047) (табл.1). Более того, в группе больных с отягощенным по ССЗ семейным анамнезом (наличие ИБС, ГБ, инсульта у родственников первой степени родства) достоверно чаще встречается генотип PON*BB (28.13% относительно 8.08% в контрольной группе, Р=0.006) и аллель PON*B (46.88% против 31.82%, Р=0.035). Очевидно, что повышенный относительный риск развития ГБ ассоциирован с генотипом PON*BB (OR=2.60, CI_OR 1.08-7.08), кроме того, он сравнительно выше у лиц с отягощенной по ГБ наследственностью (OR=4.45, CI_OR 1.38-14.51).

В группе больных ГБ по сравнению с контрольной группой повышена частота генотипа СЕТР*II (57.47% против 42.31%, Р=0.042) и понижена частота генотипа CETP*VI (33.33% против 50.96%, Р=0.019) (табл.2). Таким образом, повышенный риск ГБ ассоциирован с генотипом СЕТР*II (OR=1.84, CI_OR 0.99-3.42), пониженный риск – с генотипом CETP*VI (OR=0.48, CI_OR 0.26-0.90).

Среди больных ГБ в сравнении с группой контроля повышена частота сочетания генотипов PON1*BB и CETP*II (15.12% относительно 2.22% в контрольной группе, Р=0.002). Сочетание генотипов PON1*BB и СЕТР*II маркирует повышенный риск ГБ (OR=7.83; CI_OR 1.71-35.85). Таким образом, наблюдается аддитивность эффектов генотипов PON*BB и СЕТР*II, т.е. относительный риск заболевания по сочетанию генотипов выше, чем по каждому генотипу в отдельности (табл.3).

^th

Полученные нами результаты о значимости полиморфизмов генов PON1 и CETP в развитии ГБ характеризуются научной новизной и приоритетны.

Индивидам, обладающим генотипом PON*BB-CETP*II, мы могли бы рекомендовать контроль факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, коррекцию образа жизни путем проведения профилактических мероприятий, что позволило бы существенно понизить риск ГБ.

Способ прогнозирования развития гипертонической болезни по генетическим факторам риска, т.е. путем типирования полиморфизма Gln192Arg гена PON и полиморфизма Val421Ile гена CETP, иллюстрируется на следующих конкретных примерах.

Пример 1. Больной Б., возраст на момент обследования составил 42 года, вес – 89 кг, рост – 1.68 м, индекс массы тела (ИМТ) – 32, АД – 150/95 мм рт. ст. Жалобы на нарушение сна, периодически возникающие головные боли, тошноту, снижение умственной работоспособности, сердцебиение, боли в области сердца, связанные с подъемом артериального давления (АД). Впервые диагноз ГБ поставлен в возрасте 35 лет. Выявлен отягощенный семейный анамнез по ГБ. По результатам электро- и эхокардиографического исследования обнаружена гипертрофия левого желудочка сердца, диастолическая дисфункция левого желудочка. При исследовании глазного дна отмечены признаки гипертонической ангиопатии.

Для молекулярно-генетического тестирования у больного забрали 6 мл венозной крови, выделили ДНК, методом ПЦР провели амплификацию фрагментов генов РОN1 и СЕТР, в пределах которых локализованы полиморфные нуклеотидные замены, в 25 мкл реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 5 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции ампликонов эндонуклеазами провели электрофорез фрагментов ДНК при постоянном напряжении 250-300 вольт. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и затем электрофореграмму проанализировали при ультрафиолетовом освещении на фильтре трансиллюминатора. При исследовании установлены генотипы PON*ВВ и СЕТР*II.

Вывод: учитывая отягощенный семейный анамнез, у наблюдаемого больного необходимо было провести генетический анализ в раннем возрасте, что позволило бы определить высокий риск развития данного патологического состояния и вовремя принять профилактические меры для предупреждения развития заболевания.

Пример 2. Больной И., возраст на момент обследования составил 47 лет, вес – 77 кг, рост – 1.7 м, ИМТ – 27, АД – 160/95 мм рт. ст. Жалобы на периодически возникающие головные боли, сердцебиение, боли в области сердца, связанные с физическими нагрузками или подъемом АД. Впервые диагноз ГБ поставлен в возрасте 38 лет. Выявлен отягощенный семейный анамнез по ГБ. При электро- и эхокардиографическом исследованиях признаки гипертрофии левого желудочка отсутствуют. При исследовании глазного дна обнаружены признаки гипертонической ангиопатии.

Для проведения молекулярно-генетического тестирования у больного забрали 6 мл венозной крови, из которой была выделена ДНК, методом ПЦР проведена амплификация фрагментов генов PON1 и СЕТР в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 5 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции ампликонов эндонуклеазами провели электрофорез фрагментов ДНК при постоянном напряжении 250-300 вольт. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и проанализировали электрофореграмму при ультрафиолетовом освещении на фильтре трансиллюминатора. При исследовании установлены генотипы PON*BB и СЕТР*II.

Вывод: учитывая отягощенный семейный анамнез, у наблюдаемого больного необходимо было провести генетический анализ в раннем возрасте, что позволило бы определить высокий риск развития данного патологического состояния и вовремя принять профилактические меры для предупреждения развития заболевания.

Пример 3. Больной Ф., возраст на момент обследования составил 58 лет, вес – 65 кг, рост – 1.63 м, ИМТ – 24, АД – 160/95 мм рт. ст. Жалобы на головные боли, сердцебиение, боли в области сердца, связанные с подъемом АД. Впервые диагноз ГБ поставлен в возрасте 33 лет. При электро- и эхокардиографическом исследовании выявлена гипертрофия левого желудочка сердца, диастолическая дисфункция левого желудочка. При исследовании глазного дна обнаружены признаки гипертонической ангиопатии.

При молекулярно-генетическом тестировании у больного забрали 6 мл венозной крови для выделения ДНК, методом ПЦР провели амплификацию фрагментов генов PON1 и СЕТР в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 5 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции ампликонов эндонуклеазами провели электрофорез фрагментов ДНК при постоянном напряжении 250-300 вольт. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и электрофореграмму проанализировали при ультрафиолетовом освещении на фильтре трансиллюминатора. При исследовании установлены генотипы PON*BB и СЕТР*II.

Вывод: молекулярно-генетический анализ в раннем возрасте позволил бы определить высокий риск развития ГБ и вовремя принять профилактические меры для предупреждения развития заболевания.

Пример 4.

Больной Г., возраст на момент обследования составил 55 лет, вес – 69 кг, рост – 1.74 м, ИМТ – 26, АД – 150/95 мм рт. ст. Жалобы на нарушение сна, периодически возникающие головные боли, тошноту, снижение умственной работоспособности, сердцебиение, боли в области сердца. Впервые диагноз ГБ поставлен в возрасте 47 лет. Выявлен отягощенный семейный анамнез по ГБ. При электро- и эхокардиографическом исследовании выявлены гипертрофия левого желудочка сердца, диастолическая дисфункция левого желудочка. При исследовании глазного дна обнаружены признаки гипертонической ангиопатии.

При молекулярно-генетическом тестировании у больного забрали 6 мл венозной крови, из которой выделили ДНК, методом ПЦР провели амплификацию фрагментов генов PON1 и СЕТР в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 5 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции ампликонов эндонуклеазами провели электрофорез фрагментов ДНК при постоянном напряжении 250-300 вольт. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и электрофореграмму проанализировали при ультрафиолетовом освещении на фильтре трансиллюминатора. При исследовании установлены генотипы PON*BB и СЕТР*II.

Вывод: учитывая отягощенный семейный анамнез, у наблюдаемого больного необходимо было провести генетический анализ в раннем возрасте, что позволило бы определить высокий риск развития данного патологического состояния и вовремя принять профилактические меры для предупреждения заболевания.

Таким образом, предложенный способ современен и позволяет с высокой степенью достоверности прогнозировать развитие ГБ.

Формула изобретения

Способ прогнозирования развития гипертонической болезни по генетическим факторам риска, характеризующийся тем, что производят выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, амплификацию фрагментов генов PON1 и СЕТР, в пределах которых локализованы полиморфные нуклеотидные замены, методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и при выявлении генотипов PON*BB и СЕТР*II прогнозирует высокий риск развития гипертонической болезни у обследуемого.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.07.2007

Извещение опубликовано: 10.03.2009 БИ: 07/2009