Патент на изобретение №2286794

(54) СРЕДСТВО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНИ И КОРРЕКЦИИ ИММУННОЙ РЕАКТИВНОСТИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ТОКСИЧЕСКИХ ГЕПАТОПАТИЯХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии и иммунологии, и может быть использовано для стимуляции регенерации гепатоцитов и коррекции иммунной реактивности при экспериментальных токсических гепатопатиях. Сущность изобретения заключается в применении опиоидного пептида DSLET, имеющего формулу Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr для стимуляции репаративной регенерации печени и коррекции иммунной реактивности в условиях токсических гепатопатий. Опиоидный пептид DSLET вводят парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 50 мкг/кг массы тела в 0,1 мл физиологического раствора десятикратно с интервалом в 24 часа между инъекциями экспериментальному животному (крысе) с токсической гепатопатией. Преимущество изобретения заключается в возможности применения указанного пептида при токсических гепатопатиях. 2 табл.

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии и иммунологии, и может быть использовано для стимуляции регенерации гепатоцитов и коррекции иммунологических сдвигов в условиях токсических гепатопатий.

В условиях токсических гепатопатий может наблюдаться различная реакция иммунной системы. Поэтому для иммунокоррекции в одних случаях используются иммуностимуляторы, а в других – иммунодепрессанты. Иммуностимуляторы эффективны в борьбе с иммунодефицитами, наблюдающимися при некоторых формах патологии печени и для активации регенераторных процессов в органе. Иммуносупрессоры показаны для того, чтобы избежать повреждающего действия иммунных механизмов на печень (Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., Павлович С.И., Ильчевич Н.В. Печень и иммунологическая реактивность. – Киев: Наук. думка, 1991. – С.43), поскольку активация иммунного ответа может свидетельствовать о запуске аутоиммунных механизмов повреждения печени (Там же. С.77).

Поэтому в условиях гепатопатий предпочтение отдается препаратам выгодно сочетающих в себе как репаративные, так и иммунокорригирующие эффекты.

Синтетический опиоидный пептид DSLET (Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr) является высокоселективным лигандом опиоидных

Также предложено использовать DSLET для стимуляции репаративного остеогенеза (Ляшев Ю.Д. Опиоидные пептиды как регуляторы репаративного остеогенеза / Автореф. дисс. на соискание уч. степени д.м.н., Курск – 2002, С.41) и при ожоговой травме (Николаев С.Б. Иммунометаболические эффекты опиоидных пептидов при термических ожогах / Автореф. дисс. на соискание уч. степени к.м.н., Курск – 2004, С.10-13, С.20).

Получены данные о гастропротекторных эффектах агонистов

В качестве аналога того же назначения может быть приведен пример использования трипептида Gly-L-His-L-Lys для стимуляции физиологической и репаративной регенерации печени (Способ стимуляции физиологической и репаративной регенерации печени / М.Ю.Смахтин, И.А.Швейнов, А.А.Конопля, И.И.Бобынцев – Патент на изобретение N2214269, 20 октября 2003 г.).

Задачей изобретения является использование по новому назначению синтетического селективного лиганда (дельта)-опиатных рецепторов – пептида DSLET, имеющего формулу (Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr), а именно для стимуляции репаративной регенерации печени и коррекции иммунных сдвигов в условиях токсических гепатопатий.

Задача изобретения достигается путем применения опиоидного пептида DSLET при токсических гепатопатиях с целью стимуляции репаративной регенерации гепатоцитов и коррекции иммунной реактивности.

В настоящий момент, поскольку точно известна химическая формула этого пептида, он может быть синтезирован в любой лаборатории синтеза пептидов либо куплен у фирм, занимающихся поставкой биологически активных соединений (Sigma, ICN, Merk, Bachim и др.). Нами был использован препарат, синтезированный в Кардиологическом научном центре РАМН.

Опиоидный пептид DSLET вводят парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 50 мкг/кг массы тела в 0,1 мл физиологического раствора десятикратно с интервалом в 24 часа между инъекциями экспериментальному животному (крысе) с токсической гепатопатией.

Пример конкретного выполнения.

Пример 1. Острую токсическую гепатопатию (ОТГ), сопровождающуюся повышением иммунной реактивности, вызывали у крыс путем пятикратного (один раз в сутки) внутримышечного введения 50% раствора тетрахлорметана (ТХМ) в растительном масле в дозе 3 мл/кг массы, чередуя лапы (Конопля А.И. Эндогенные имуномодуляторы как фактор сохранения гомеостаза при патологии печени: Дис….д-ра мед. наук – Киев, 1989. – 312 с.). Крысы Вистар были разделены на группы по 8-9 крыс в каждой. Группы животных представлены в таблице 1.

Соответствующая навеска DSLET растворялась в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводилась животным в объеме 0,1 мл десятикратно (один раз в сутки) внутрибрюшинно в дозах 1,5; 50 и 150 мкг/кг массы (до и одновременно с введением ТХМ). На следующий день после последнего введения крыс забивали обескровливанием под эфирным наркозом, выделяли печень. Кусочки органов фиксировали в 10% нейтральном формалине на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2 и заливали в парафин по общепринятой методике. Из этих органов изготовляли парафиновые срезы, окрашивали гематоксилином и эозином, после чего изучали морфологическую картину органа, подсчитывая количество митозов и двуядерных гепатоцитов (Саркисов Д.С. Микроскопическая техника – М.: Медицина, 1996. – 543 с.). Вычисляли митотический индекс (МИ), отражающий активность клеточной формы регенерации, и индекс двуядерных гепатоцитов (ИДГ), показывающий выраженность ацитокинетической активности гепатоцитов как формы внутриклеточной регенерации и резерва полиплоидизации (Саркисов Д.С. 1987. Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций: Руководство / Под ред. Д.С.Саркисова. – М.: Медицина, 1987. – 448 с.) Во всех дозах, начиная с дозы 1,5 мкг/кг, пептид повышал МИ и ИДГ (таблица 1).

Такие же группы животных были взяты для изучения состояния иммунологической реактивности. Об интенсивности гуморального иммунного ответа (ГИО) судили по количеству антителообразующих (АОК) клеток в селезенке на 5-й день после иммунизации экспериментальных животных (крысы) (Мальберг К., Зигль Э. Иммунологические методы / Под. ред. Г.Фримеля; Пер. с нем. А.П.Тарасова. – М., 1987 – с.273-282). В качестве антигена использовали эритроциты барана (ЭБ), которые вводили внутрибрюшинно одновременно с последней инъекцией гепатотропного яда. Пептид вводился до, во время и после иммунизации.

Результаты эксперимента представлены в таблице 1. Введение ТХМ сопровождается развитием ОТГ и стимуляцией ГИО на Т-зависимый антиген-ЭБ.

Таблица 1
Гепато- и иммунотропные эффекты DSLET (M±m) в условиях ОТГ, вызванной ТХМ.
Условия опыта	МИ	ИДГ	АОК (103) на селезенку
1. Интактные животные	4,2±0,8	168,6±11,4	31,6±5,3
2. Введение масла и изотоничного раствора	5,8±1,1	179,9±11,9	32,7±5,4
3. Введение ТХМ и изотоничного раствора	10,3±2,1*1, 2	233,7±15,2*1, 2	86,3±10,4*1, 2
4. Введение ТХМ и DSLET в дозе 1,5 мкг/кг	19,2±3,2*1-3	316,2±17,2*1-3	35,9±6,1*3
5. Введение ТХМ и DSLET в дозе 50 мкг/кг	18,4±2,7*1-3	263,8±16,1*1, 2, 4	43,5±6,8*3
6. Введение ТХМ и DSLET в дозе 150 мкг/кг	19,6±3,4*1-3	265,1±16,9*1, 2, 4	34,3±5,9*3
Примечание: 1. МИ – митотический индекс гепатоцитов (). 2. ИДГ – индекс двуядерных гепатоцитов (). 3. АОК (103) на селезенку – количество антителообразующих клеток, тыс./селезенку. 4 – показывает достоверные отличия, Р<0,05. 5. Цифры рядом со звездочкой означают номера групп, с какими сравнивались различия.

В этих условиях введение пептида во всех использованных дозах стимулирует репаративную регенерацию гепатоцитов и нормализует иммунологическую реактивность, что можно расценивать как положительный эффект, препятствующий гиперактивации иммунной функции и возможному развитию аутоиммунных осложнений. (Алексеева И.Н., Брызгина Т.М., Павлович С.И., Ильчевич Н.В. Печень и иммунологическая реактивность. – Киев: Наук. думка, 1991. – С.43, С.77).

Пример 2. В качестве модели острой токсической гепатопатии, сопровождающейся снижением иммунной реактивности, использовали поражение печени однократным внутрибрюшинным введением солянокислого гидразина (50 мг/кг) (Иванова А.П. Формирование иммунного ответа и его коррекция при токсическом поражении печени различной этиологии: Дис….канд. мед. наук – Курск, 1995. – 140 с.).

Соответствующая навеска DSLET растворялась в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводилась животным в объеме 0,1 мл десятикратно (один раз в сутки) внутрибрюшинно в тех же дозах 1,5; 50 и 150 мкг/кг массы (в течение 5 дней до поступления гидразина, одновременно и в течение 4 дней после него). На следующий день после последнего введения крыс забивали обескровливанием под эфирным наркозом, выделяли печень. Кусочки органов фиксировали в 10% нейтральном формалине на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2 и заливали в парафин по общепринятой методике. Из этих органов изготовляли парафиновые срезы, окрашивали гематоксилином и эозином, после чего изучали морфологическую картину органа, подсчитывая количество митозов и двуядерных гепатоцитов и вычисляли МИ и ИДГ. Во всех дозах, начиная с дозы 1,5 мкг/кг, пептид повышал ИДГ более выражено в дозах 50 и 150 мкг/кг (таблица 2), влияя преимущественно на внутриклеточную форму регенерации в этих условиях.

Такие же группы животных были взяты для изучения состояния иммунологической реактивности. Об интенсивности гуморального иммунного ответа (ГИО) также судили по количеству антителообразующих (АОК) клеток в селезенке на 5-й день после иммунизации экспериментальных животных (крысы). Пептид вводился до, во время и после иммунизации эритроцитами барана (ЭБ). Иммунизацию проводили одновременно с введением гидразина.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2. Введение гидразина сопровождается развитием ОТГ и снижением ГИО на Т-зависимый антиген-ЭБ. В этих условиях введение пептида во всех использованных дозах также стимулирует репаративную регенерацию гепатоцитов (повышает ИДГ)

Таблица 2
Гепато- и иммунотропные эффекты DSLET (M±m) в условиях ОТГ, вызванной гидразином.
Условия опыта	МИ	ИДГ	АОК (103) на селезенку
1. Интактные животные	4,6±0,7	154,6±10,2	28,7±5,1
2. Введение изотоничного раствора	5,4±1,1	162,3±11,1	30,2±5,8
3. Введение гидразина и изотонического раствора	10,5±2,1*1, 2	226,8±12,4*1, 2	15,4±2,6*1, 2
4. Введение гидразина и DSLET в дозе 1,5 мкг/кг	9,1±1,8*1, 2	298,0±14,6*1-3	10,8±2,1*1, 2
5. Введение гидразина и DSLET в дозе 50 мкг/кг	11,5±2,2*1, 2	360,3±15,4*1-4	23,9±2,4*2-4
6. Введение гидразина и DSLET в дозе 150 мкг/кг	12,4±2,8*1, 2	385,6±16,1*1-4	22,3±2,2*2-4
Примечание: 1. МИ – митотический индекс гепатоцитов (). 2. ИДГ – индекс двуядерных гепатоцитов (). 3. АОК (103) на селезенку – количество антителообразующих клеток, тыс./селезенку. 4. В каждой группе было по 8-9 животных. 5 – * – показывает достоверные отличия, Р<0,05. 6. Цифры рядом со звездочкой означают номера групп, с какими сравнивались различия.

и нормализует иммунологическую реактивность, устраняя тем самым иммунодефицитное состояние, в дозах 50 или 150 мкг/кг. В дозе 1,5 мкг/кг иммунокорригирующий эффект DSLET не наблюдался, поэтому наименьшей эффективной дозой в этих условиях можно считать – 50 мкг/кг. Поскольку эта доза пептида была одинаково эффективна как в условиях гепатопатии с повышенной (отравление ТХМ) или сниженной иммунной реактивностью (отравление гидразином) в дальнейшем можно рекомендовать именно дозу 50 мкг/кг как наиболее универсальную и экономичную (по сравнению с дозой 150 мкг/кг). Репаративный же эффект DSLET проявлялся во всех использованных дозах.

Таким образом, в условиях токсических гепатопатий, отличающихся по исходному уровню иммунной реактивности (как с ее повышением, так и снижением) опиоидный пептид DSLET стимулирует репаративную регенерацию гепатоцитов и корригирует состояние иммунной реактивности.

Формула изобретения

Применение опиоидного пептида DSLET, имеющего формулу Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr, для стимуляции репаративной регенерации гепатоцитов и коррекции иммунной реактивности при экспериментальных токсических гепатопатиях.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.04.2007

Извещение опубликовано: 27.07.2008 БИ: 21/2008