Патент на изобретение №2286576
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПЕРЕКРЕСТНОРЕАГИРУЮЩИХ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МЕЛИОИДОЗА, САПА, ЧУМЫ, ТУЛЯРЕМИИ И ТУБЕРКУЛЕЗА
(57) Реферат:
Изобретение относится к области лабораторной диагностики, а именно к разработке эффективного способа выявления у Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Yersinia pestis, Francisella tularensis и Mycobacterium tuberculosis общих и перекрестнореагирующих антигенов с одновременным определением их основных физико-химических характеристик. Сущность изобретения состоит в том, что проводят адсорбцию перекрестнореагирующих антигенов на иммунокомплексоне IgG×Al(OH)3 с дополнительным осаждением IgG стафилоккоковым реагентом с протеином А и последующим определением молекулярных масс перекрестнореагирующих антигенов путем анализа полученных адсорбированных и неадсорбированных препаратов в ДСН-ПААГ электрофорезе и иммуноблоттинге. Техническим результатом является разработка высокочувствительного способа выявления кластера перекрестнореагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза с одновременным установлением их основных физико-химических характеристик. 1 ил.
(56) (продолжение): CLASS=”b560m”for serological diagnosis of tularemia, Clin Diagn Lab Immunol. 2004 Nov; 11(6):1008-1015. RASMUSSEN KR et al Isolation and partial characterization of an antigen shared between Schistosoma mansoni, Fasciola hepatica, and Biomphalaria glabrata, J Parasitol. 1985 Dec; 71(6):792-798. WO 9506732, A2, 09.03.1995.
Изобретение относится к медицине и касается разработки эффективного способа выявления у Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Yersinia pestis, Francisella tularensis и Mycobacterium tuberculosis общих и перекрестнореагирующих антигенов с одновременным определением их основных физико-химических характеристик. Данное направление обусловлено проявлением перекрестного иммунитета при вакцинации указанными микроорганизмами экспериментальных животных, а также отсутствием должной специфичности идентификационных иммунодиагностических методов за счет общности антигенных эпитопов клеток указанных видов микроорганизмов. Однако, как в аналогах, так и в прототипе, описаны приемы выявления перекрестнореагирующих антигенов, не позволяющие в рамках одного исследования определить их истинное количество, химическую природу, молекулярную массу и специфическую адсорбционную способность, являющуюся одним из доказательных факторов наличия общих антигенных эпитопов. Целью изобретения является разработка высокочувствительного способа выявления кластера перекрестнореагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза с одновременным установлением их основных физико-химических характеристик, являющихся базовыми для последующего методического подхода при препаративном получении отдельных антигенных комплексов – потенциальных кандидатов для конструирования иммунопрофилактических и иммунодиагностических средств. Цель достигается тем, что проводят адсорбцию перекрестнореагирующих антигенов на иммунокомплексоне. Комплексон готовят путем добавления 270 мг Al(ОН)3 Пример 1. Получение водносолевых экстрактов изучаемых видов микроорганизмов. В работе используют следующие штаммы возбудителей: B.mallei 10230, Ц-5М, В-120; B.pseudomallei 100, 111, 57576, 100-16-1 – авирулентный мутант, дефектный по гликопротеину 200 kDa; В. thailandensis E251, 264, 265, 295, 299; Y.pestis 231, EV; F. tularensis 15 НИИЭГ, 503; M. bovis (БЦЖ), M.tuberculosis H37Rv. Для инкубирования буркхольдерий (37°С, 48 ч) используют Nutrient Broth и Nutrient Agar (“Difco”). Штаммы возбудителя чумы выращивают на агаре и бульоне Хоттингера рН 7.2 (28°С, 48 ч). F.tularensis инкубируют на агаровой среде с сердечно-мозговым экстрактом (“Difco”) с добавлением цистеина 0.1%, глюкозы 1% и дефибринированной крови кролика 5-7%, микобактерии туберкулеза – на среде Bacto Middlebrook Agar 711-10 (“Difco”) в течение 9 сут при 37°С в атмосфере 5% CO2. Выращенную биомассу инактивируют и высушивают охлажденным до -30°С ацетоном. Сухие клетки в количестве 50.0 мг суспендируют в 3.5 мл 0.15 М раствора NaCl с фосфатным буфером рН 7.2. Суспензию гомогенизируют на магнитной мешалке в течение 3 ч при температуре 4°С, после чего при помощи дезинтегратора Artek-150 (“Artek”, США) подвергают воздействию ультразвука частотой 20 кГц и мощностью 75 Вт в течение 3 мин трехкратно с охлаждением, осаждают центрифугированием при 20000 g в течение 1 ч при 4°С. Супернатант отделяют и фильтруют через мембрану ДР-0.45 (“Amicon”), концентрируют и диализуют против дистиллированной воды на мембране РМ-10. Полученный водно-солевой экстракт исследуют на наличие перекрестнореагирующих антигенов. Пример 2. Дифференциальная адсорбция перекрестнореагирующих антигенов на комплексоне IgG против В. pseudomallei 100×Al(ОН)3. Для выявления перекрестнореагирующих антигенов используют препараты водно-солевых экстрактов исследуемых видов микроорганизмов: B.pseudomallei 100, В. mallei 10230, B.thailandensis E299, Y. pestis EV, F. tularensis 15, M.tuberculosis H37RV. Для адсорбции водно-солевых экстрактов используют IgG против В. pseudomallei 100×Al(ОН)3 комплексен, приготовление которого и методика адсорбции описаны выше. На 11% ДСН-ПААГ наносят параллельно по 10-15 мкл адсорбированных и неадсорбированных препаратов водно-солевых экстрактов исследуемых видов бактерий и проводят электрофорез (Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. – Nature. – 1970. – V. 227. – P.680-685). Электрофорез проводят при стабилизированном токе 5 mA в течение 18 ч. В качестве эталонов молекулярных масс используют наборы маркерных белков 10-78 кД (LKB) и 25-92.5 кД (Serva). Окрашивание электрофореграмм проводят с помощью кумасси бриллиантового синего G-250 (Serva). Далее проводят компьютерный анализ электрофореграмм, который позволяет установить, что мелиоидозные IgG перекрестно реагируют с антигенами возбудителя чумы (протеины с молекулярной массой 44, 42, 38, 32, 23 и 19 кД), возбудителя туляремии (34 и 30 кД) и возбудителя туберкулеза (81, 46, 29, 17 и 15 кД). Что касается близкородственных видов В. mallei и B.thailandensis, то их антигенный спектр весьма схож с B.pseudomallei, однако данный методический подход позволяет выявлять у них и индивидуальные протеиновые антигены (см. чертеж). Примененный высокочувствительный метод детекции перекрестнореагирующих антигенов позволяет достаточно точно определить их количественный состав и молекулярные массы. В качестве верификационного теста применяют иммунноблоттинг. Таким образом, предлагаемый способ выявления перекрестнореагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии, туберкулеза позволяет достоверно с высокой чувствительностью выявлять не только перекрестнореагирующие, но и общие, и индивидуальные антигены, что делает возможным конструирование адекватных иммунодиагностических препаратов, а также использование отдельных антигенов в составе химической вакцины, возможно, универсальной для указанной группы возбудителей инфекционных заболеваний.
Формула изобретения
Способ выявления перекрестнореагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза, включающий получение антигенного препарата исследуемых бактерий, специфическую адсорбцию, ДСН-ПААГ электрофорез, отличающийся тем, что для эффективного выявления перекрестнореагирующих антигенов адсорбируют антигенный препарат исследуемых бактерий на иммунокомплексоне, приготовленном на бидистиллированной воде путем смешивания 200 мкл суспензии Al(ОН)3 в концентрации 27 мг/мл и 200 мкл препарата IgG против В. pseudomallei 100 в концентрации 32,5 мг/мл, выдерживают 16 ч при 4°С, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин, к осадку комплексона добавляют 100 мкл антигенного препарата исследуемых бактерий, экспонируют в течение 16 ч при 4°С, к 70 мкл надосадка добавляют равное количество 10% стафилококкового реагента, содержащего белок А, после экспозиции в течение 16 ч при 4°С препарат центрифугируют при 5000 об/мин 20 мин, супернатант переосаждают охлажденным ацетоном (-20°С) и анализируют в ДСН-ПААГ электрофорезе параллельно с неадсорбированным антигенным препаратом исследуемых бактерий, по разнице антигенного состава устанавливают наличие перекрестнореагирующих антигенов.
РИСУНКИ
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 22.12.2006
Извещение опубликовано: 20.06.2008 БИ: 17/2008
|
||||||||||||||||||||||||||
