Патент на изобретение №2286383
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ SHIGELLA SONNEI, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРА ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ КОЛИЦИНОВ ГРУППЫ Е3 (Е3, Е4, Е5, Е6) У ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области микробиологии, а именно к поиску индикаторного штамма для идентификации колицинов группы Е3 (Е3, Е4, E5, Е6). Получен штамм, обладающий чувствительностью к колицинам группы Е3 (r.Е3), пригодный для колициногенотипирования энтеробактерий – их дифференцировки по типам продуцируемых колицинов. Штамм Shigella sonnei получен путем генетико-селекционных приемов, чувствительный к колицинам группы Е3 (Е3, Е4, Е5, Е6) – мутант типового штамма Sh.sonnei P9 Фредерика. Штамм депонирован в коллекции Хабаровского НИИЭМ под №24. Использование штамма Sh.sonnei №24 позволяет выявлять единичные колицины группы Е3 или их комбинации с другими колицинами у энтеробактерий. 5 табл.
Изобретение относится к области микробиологии, а именно к поиску индикаторного штамма для идентификации колицинов группы Е3 (Е3, E4, Е5, Е6). Существующие в мировой науке системы типирования основаны на выявлении колицинопродукции (col-факторов) с помощью универсальных индикаторов, а затем на типизации колицинов путем тестирования с индикаторами, чувствительными или резистентными к определенным колицинам или их сочетаниям. Известны несколько систем или схем колициногенотипирования энтеробактерий (4, 5, 6). В каждой из систем существует свой набор эталонных типовых культур-продуцентов колицинов и индикаторов к ним В России в разные годы использовали схемы Фредерика, Эббота и Шеннона, ряд авторских схем. За рубежом используется схема В.Горака. Схема Фредерика (5) включает 17 типовых тест-культур, имеющих буквенное обозначение продуцируемых колицинов – группа Е (E1, E2, Е3), I, В, D, K и т.д. Коллекция тест-культур имеется в ГИСК им. Тарасовича. Однако авторской коллекции индикаторов к этому набору ГИСК не имеет. Не зарегистрирована такая коллекция индикаторов в Каталоге штаммов Чехословацкой национальной коллекции типовых культур, имеющей международный статус (9). Набор индикаторов, позволявший идентифицировать ограниченное число типов колицинов, использовался рядом авторов (1-3). Коллекция под названием индикаторов Н.В.Давыдовой, имевшаяся в распоряжении лаборатории кишечных инфекций Хабаровского НИИЭМ, позволяла диагностировать колицины группы Е (E1, E2), I, В, K, D, V и отдельные их сочетания. В коллекции не было индикаторов для выявления колицина Е3. В схеме Эббота и Шеннона (4) колицины имеют условное цифровое обозначение (1а, 1в, 2, 3 и т.д. до 15). ГИСК им. Тарасовича располагает коллекцией типовых тест-культур 17 наименований и 15 индикаторов. Схема достаточно громоздка, типы колицинов обозначены условно цифрами, они до недавнего времени не были соотнесены с общепринятым буквенным обозначением типов колицинов. Система контроля индикаторов не была разработана. Разработанная новая система типирования колицинов В.Горака методически хорошо обеспечена (6, 7, 8). Состав коллекции типов и индикаторов содержится в Чехословацком каталоге культур (9). Коллекция типов тест-культур, основанная первоначально на наборе Эббота и Шеннона, включает 67 наименований от 1а до 67 типов. Определены соответствующие схеме Фредерика буквенные аналоги колицинов. Число индикаторов включает свыше 60 наименований, что позволяет определять множество различных комбинаций колицинов у поликолициногенных штаммов, в том числе колицины Е4, E5, Е6. Схема может быть использована только в специализированных исследовательских лабораториях, обеспечивающих поддержание многочисленной коллекции в рабочем состоянии. Хабаровский НИИЭМ с 1971 г. ведет слежение за циркуляцией возбудителей дизентерии Зонне на территории Дальнего Востока, используя колициновый маркер шигелл. Для получения сопоставимых результатов пользуется единой методикой, усовершенствуя и дополняя ее, с применением ограниченного числа индикаторов. В основе методики – схема Фредерика. Для типизации колицинов используют группы индикаторов различного механизма действия. 1. Индикаторы, чувствительные к отдельным колицинам или их сочетаниям. Удобны для выявления множественных колицинов. Индикатор работает на определенный колицин в любом сочетании. 2. Индикаторы, резистентные к отдельным колицинам или их сочетаниям (отсутствие рецепторов фиксации у индикатора для соответствующего колицина – внешнее исключение действия колицина на индикатор). Непригодны без дополнительных индикаторов для типирования множественных колицинов: мутанты, резистентные к одному колицину, подавляются другими колицинами. 3. Индикаторы, иммунные к действию определенного колицина вследствие носительства одноименной col-плазмиды (внутреннее исключение действия одноименного колицина типируемого штамма на индикатор, обеспеченное иммунитетом индикатора). Наиболее специфичны. Типирующие способности индикаторов (спектр) определяют по их взаимодействию с набором тест-культур продуцентов колицинов. Идентификация колицинов группы Е (Е3, E4, E5, Е6) затруднена вследствие отсутствия в отечественных коллекциях индикаторов различного механизма действия. Нет четких представлений и о классификации этой группы колицинов. В дальнейшем эта группа колицинов обозначена символом Е3. Цель изобретения – получение штамма, обладающего чувствительностью к колицинам гр. Е3 (ч. Е3), что позволяет выполнять колициногенотипирование энтеробактерий – их дифференцировку по типам продуцируемых колицинов. Цель достигается тем, что путем генетикоселекционных приемов разработан штамм Shigella sonnei, чувствительный к колицинам группы Е3 (Е3, E4, E5, Е6) – мутант типового штамма Sh.sonnei P9 Фредерика, используемый в качестве чувствительного индикатора для типирования колицинов группы Е3 (Е3, E4, E5, Е6) у энтеробактерий. Штамм Sh.sonnei, чувствительный к колицинам группы Е3 (Е3, E4, E5, Е6), хранится в коллекции индикаторных культур для типирования колицинов в лаборатории кишечных инфекций Хабаровского НИИЭМ под №24. Культурально-морфологические признаки. г – неподвижные палочки, спор и капсул не образуют. На МПА – рост S и переходных форм колоний сероватого цвета, умеренно выпуклых, без запаха. На среде Эндо – бесцветные, S и переходная форма. На МПБ – равномерная муть. Пленок не образует. Оптимум роста +37° в течение 18-24 часов. Биохимические признаки. а) характеристики, позволяющие отнести штамм микроорганизма, чувствительного к колицину Е3 (ч. Е3), к семейству Enterobacteriacea, роду Shigella.
б) отношение к углеводам, аминокислотам:
Штамм хранится в столбике 0,6% полужидкого агара под слоем вазелинового масла при комнатной t° в течение 1 года без пересева или на МПА (чашки Петри или пробирки) в холодильнике с пересевом 1 раз в 15 дней. Индикаторные свойства штамма ч.Е3 установлены при испытании его с набором стандартных тест-штаммов продуцентов колицинов из коллекции Фредерика и Горака (таблицы 1, 2). В основе методики – а) выявление колициногенной активности штаммов-продуцентов с помощью универсального индикатора Е.coli K12; б) типирование колицинов – т.е. выявление среди колициногенных штаммов продукции колицинов гр. Е3 с помощью специфических штаммов – индикаторов. Эти два этапа выполняются одновременно. Определение колициногенной активности и колициногенотипирование проводят двуслойным методом отсроченного антагонизма Фредерика (5). Односуточные тест-штаммы продуценты колицинов засевают уколом петли в слой 1,5% МПА (агар-агар+бульон Хоттингера, либо коммерческий питательный агар+мясо-пептонный бульон), разлитого в чашки Петри. На одну чашку одновременно засевают 8-9 испытуемых культур. Каждый штамм засевают параллельно на несколько чашек, соответственно числу используемых индикаторов, при этом колицины, продуцируемые штаммами, диффундируют в среду. После двухсуточной инкубации при 37° выросшие колонии стерилизуют парами хлороформа в течение 2-х часов. Для этого хлороформ (0,5 мл) наносят на квадраты фильтровальной бумаги, размещенные в крышках чашек Петри, затем чашки с засеянной средой закрывают для экспозиции. При этом крышки с хлороформом располагаются снизу, а чашки со средой накрывают их сверху. Через 2 часа пары хлороформа удаляют, оставляя чашки открытыми в течение 30 мин. Фильтровальную бумагу также удаляют, а поверхность агара засевают культурой индикатора. Одну чашку – универсальным индикатором Е.coli K12, вторую – индикатором, чувствительным к колицинам гр. Е3, третью – индикатором, чувствительным к колицину E1 (для контроля). Для этого 0,1 мл суточной или 6-часовой бульонной культуры индикаторного штамма вносят в пробирку с 3-4 мл расплавленного и охлажденного до 45 полужидкого 0,6% агара и после перемешивания содержимое пробирки выливают (наслаивают) на поверхность первого агарового слоя. Через 18-20 часов инкубирования посевов в термостате проводят учет результатов опыта. Определяют наличие или отсутствие зон подавления роста индикаторных культур под действием колицинов, величину зон и их характер, получая дополнительную информацию о сходстве или различиях типов колицинов. Наличие зон подавления роста универсального индикатора Е.coli K12 означает, что тест-штаммы действительно продуцируют колицины и можно приступить к оценке действия типирующих индикаторов. При испытании индикаторного штамма с набором культур-продуцентов колицинов Фредерика (табл.3) установлено, что индикаторный штамм действительно выявляет только колицин Е3 типового штамма Са 38 Фредерика (знак «плюс» в схеме). Индикатор остается инертным к воздействию колицинов, продуцируемых остальными тест-штаммами этой коллекции. Взятый для контроля индикатор, чувствительный к колицину Е1, выявляет только колицин Е1 (синоним S5) и не выявляет колицин Е3. Как следует из таблицы 4, все тест-культуры Горака, кроме типа 7, продуцируют колицины, выявляемые универсальным индикаторным штаммом Е.coli K12. Испытуемый индикаторный штамм ч. Е3 выявляет все колицины группы Е3 (E4, Е5, Е6) как одиночные, так и в сочетаниях с другими колицинами (без дифференциации на подтипы). Чувствительный индикатор действует строго специфично, выявляя только колицины группы Е3 и оставаясь инертным ко всем другим колицинам. Таким образом, сравнение предлагаемого штамма Sh.sonnei ч. Е3 с известными индикаторами (ч. E1) показывает, что штамм Sh.sonnei ч.Е3 чувствителен только к колицинам Е3 (Е3, E4, Е5, Е6) типовых штаммов коллекции Фредерика и Горака и позволяет выявлять единичные колицины группы Е3 или их комбинации с другими колицинами у энтеробактерий. При этом не дифференцирует их на типы Е3, E4, Е5, Е6. Пример конкретного использования индикаторного штамма ч. Е3. Для индикации колицинов Е3 у энтеробактерий – одиночных или в сочетании с другими колицинами, индикаторный штамм ч. Е3 используют как самостоятельно, так и в комплексе с другими индикаторными штаммами. Испытуемые штаммы энтеробактерий (Sh. sonnei №1 и №2) засевают уколом в среду для накопления колицина [метод отсроченного антагонизма Фредерика (5)]. Наличие колициногенной активности устанавливается с помощью универсального индикатора Е.coli K12. Для установления типа колицинов применили два типирующих индикатора – чувствительный к колицинам группы Е3 (предмет изобретения) и чувствительный к колицину E1. Как следует из таблицы 5, оба штамма продуцируют колицины (знак + на универсальном индикаторе Е.coli K12). Штамм Sh.sonnei №1 продуцирует колицины Е3, так как специфический чувствительный индикатор реагирует на «свой» колицин зоной задержки роста (знак + в таблице). Индикатор ч. E1 остается инертным. У штамма Sh.sonnei №2, напротив, колицин гр. Е3 не выявлен, т.к. индикатор ч. Е3 остается инертным; выявлен колицин Е1. ЛИТЕРАТУРА 9. Catalogue of Pathogenic Microorganisms. The Czechoslovak National Collection of Type Cultures. Fifth Edition. Prague, 1990. – 125 p.
Формула изобретения
Штамм бактерий Shigella sonnei, депонированный в коллекции лаборатории кишечных инфекций Хабаровского НИИЭМ под №24, используемый в качестве индикатора для типирования колицинов группы Е3 (Е3, Е4, Е5, Е6) у энтеробактерий.
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 31.07.2009
Извещение опубликовано: 20.12.2010 БИ: 35/2010
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
