Патент на изобретение №2286166

(54) ПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИКОАГУЛЯНТНО-ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ, АНТИТРОМБОЦИТАРНОЙ И АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

(57) Реферат:

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается антитромбического, антикоагулянтного, фибриндеполимеризационного и фибринолитического средства, содержащего новые пептиды общей формулы: X-Pro-Gly-Pro, где X=Phe-, Arg-, Lys-Pro-Arg-, Glu-His-Phe-. Заявленное средство обладает высокой активностью и эффективностью по сравнению с известными средствами. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, к средствам, обладающим антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной и антитромботической активностью.

Однако гепарин не обладает антитромбоцитарной и фибринолитической активностью. При передозировке гепарина его высокомолекулярные фракции вызывают нежелательные побочные явления кровоточивости.

Однако она не обнаруживает антикоагулянтно-фибринолитической и антитромботической активности и вызывает нежелательные побочные явления – кровоточивость со стороны желудочно-кишечного тракта.

Однако он не проявляет антикоагулянтной, антитромбоцитарной и анитромботической активностей.

Известны пептиды, продукты расщепления фибриногена, обладающие антитромботической, антитромбоцитарной активностью и вызывающие локальный фибринолиз (Standker L., Sillard R., Bensch K.W., Ruf A., Raida M., Schulz-Knappe P., Shenky A.G., Patscheke H., Forssmann W.-G. In vivo degradation of human fibrinogen A

Однако данные известные пептиды не обладают антикоагулянтной активностью.

Известны пептиды Gly-Pro, Trp-Pro, Pro-Gly, Gly-Pro-Gly-Gly и Pro-Gly-Pro, обладающие антикоагулянтной и фибринолитической активностью (В.Е.Пасторова, Л.Я.Ляпина. Т.Ю.Смолина. И.П.Ашмарин. Антикоагулянтные и фибринолитические эффекты некоторых пролинсодержащих пептидов. Известия АН. Серия биологическая. 1998. №3, с.390-394) [5].

Однако все эти пептиды не обладают антитромбоцитарной и антитромботическрй активностью.

Известны пептиды Pro-Gly и Pro-Gly-Pro, обладающие антитромбоцитарной активностью (В.Е.Пасторова, Л.А.Ляпина, И.П.Ашмарин, Р.У.Островская, Т.А.Гудашева, Э.В.Луговской. Фибриндеполимеризационная активность и антитромбоцитарный эффект циклического и линейных коротких пролинсодержащих пептидов. Известия АН. Серия биологическая, 2001, №5, с.593-596) [6].

Однако данные известные пептиды обладают слабым антикоагулянтным действием.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является расширение спектра действия и эффективности пептидов, рекомендация к применению группы пептидов, обладающих, комплексом свойств: антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной и антитромботической активностью.

Указанный технический результат достигается тем. что пептиды общей формулы:

Х-Pro-Gly-Pro, где

X=Arg-,

Phe-,

Lys-Pro-Arg-,

Glu-His-Phe -,

обладают антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной и антитромботической активностью.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Синтез ниже представленных пептидов осуществляли методами классической пептидной химии в растворе. При синтезе использовали производные L-аминокислот. Упаривание растворов проводили на вакуумном испарителе при 40°С. Температуры плавления, определенные на столике для плавления Boetiys, даны без исправления. Индивидуальность полученных соединений проверяли с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем фирмы Silufol (Чехия). Вещества обнаруживали в УФ-свете, с помощью нингидрина, реагентов Бартона, Паули и Рейнделя-Хоппе, о-толидина в среде хлора. Удельное вращение определяли на поляриметре марки “А1-ЕПО”. Проверку гомогенности пептида проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Все растворители соответствующим образом абсолютировали. Точки плавления не корректировали.

Приведены хроматографические подвижности (Rf) в системах растворителей: бутанол: уксусная кислота:вода (4:1:1) (1); этилацетат:ацетон: 50% уксусная кислота:вода (2:1:1) (2); бензол:этанол (8:2) (3); хлороформ:метанол:аммиак (7:2.5:0.5) (4); хлороформ:метанол:аммиак (6:4:1) (5); хлороформ:метанол:уксусная кислота (42:7:1) (6); ацетон:бензол:уксусная кислота (50:100:1) (7); хлороформ:метанол (9:1) (8); гексан:ацетон (3:2) (9); метанол (10); бутанол:уксусная кислота:пиридин:вода (30:6:20:24) (11); хлороформ:метанол (14:1) (12); изопропанол:муравьиная кислота:вода (20:5:1) (13); этанол:аммиак (7:3) (14). После приведенных величин Rf в скобках указан номер системы растворителей.

Принятые сокращения:

Вос – трет-бутилоксикарбонил

ДМФА – диметилформамид

ДЦГК – дициклогексилкарбодиимид

ДЦМ – дициклогексилмочевина

ОБТ – оксибензотриазол

OBzl – бензиловый эфир

OBu^t – трет-бутиловый эфир

OEt – этиловый эфир

ОМе – метиловый эфир

OPfp – пентафторфениловый эфир

PivCl – пивалоил хлорид

Z – бензилоксикарбонильная группа (КБЗ)

ТГФ – тетрагидрофуран

ТСХ – тонкослойная хроматография

ТФУ – трифторуксусная кислота

ТЭА – триэтиламин

ЭА – этилацетат

Пример 1. Синтез Arg-Pro-Gly-Pro.

I. Boc-Pro-Gly-OEt. Boc-Pro-OH 8,3 г (3,45 ммоль) растворяли в 50 мл СН₂Cl₂, охлаждали до +5°С, добавляли 38,45 ммоль (5,38 мл) ТЭА. Реакционную смесь охлаждали до -25÷-30°С. При этой температуре из пипетки прибавляли 38,45 ммоль (4,84 мл) изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты. Температуру реакционной смеси удерживали в интервале -18÷-20°С 20 минут. Одновременно готовили раствор 5,9 г (42,3 ммоль) избыток 1,1 HCl-H-Gly-OEt в 75 мл хлороформа, содержащего 5,92 мл ТЭА. Раствор охлаждали до -25°С и, после образования смешанного ангидрида в первой колбе ее содержимое приливали сразу же к раствору эфира. Реакционную смесь выдерживали 1 час при температуре -10°С и затем 12 часов при температуре +4°С при перемешивании на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали, добавляли 250 мл этилацетата, раствор этилацетата промывали 3 раза по 25 мл 0,1 н. HCl, 3 раза по 25 мл Н₂О, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, отфильтровали и упаривали. Остаток высушивали в вакууме над P₂O₅/KOH и парафином.

Выход – 10,2 г (30,3 ммоль) 78,83%

Rf – 0,5 (7); 0,862 (8)

Т.пл. 68-70°С.

II. Boc-Pro-Gly-N₂H₃. Boc-Pro-Gly-OEt 10,2 г (30,3 ммоль) растворяли в 80 мл абсолютного метанола, добавляли 4-х кратный избыток гидразин-гидрата 5,88 мл (121,2 ммоль). Перемешивали 12 часов на магнитной мешалке при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, два раза упаривали с эфиром, остаток заливали эфиром (˜5 мл) и оставляли в холодильнике на ночь (для лучшей кристаллизации добавляли затравку). Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром, сушили в эксикаторе.

Выход – 6,9 г (20,79 ммоль) 68,62%

Rf – 0,284 (7); 0,474 (8); 0,189 (9)

Т.пл. 98-100°С.

III. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl. К охлажденному до -20°С раствору Boc-Pro-Gly-N₂H₃ 4,7 г (14,6 ммоль) в 40 мл ДМФА добавляли 58,4 ммоль (4-х кратный избыток) раствора хлористого водорода в этилацетате и сразу же 1,73 мл (14,6 ммоль) свежеперегнанного трет-бутилнитрита, реакционную смесь перемешивали 30 минут при -5°С. Реакционную смесь охлаждали до -40°С и добавляли охлажденный до -10°С раствор 8,2 мл (58,4 ммоль) ТЭА в 4 мл ДМФА; когда температура реакционной смеси повышалась до -20°С, добавляли 3,7 г (15,3 ммоль) избыток 1,05 HCl-H-Pro-OBzl в 20 мл ДМФА и 2,14 мл ТЭА. Выдерживали при 4°С 24 часа, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в 200 мл этилацетата и промывали 2 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл Н₂O, 3 раза по 20 мл 5% раствором NaHCO₃, 3 раза по 20 мл Н₂О. Этилацетатный слой высушивали над MgSO₄. Упаривали, остаток заливали небольшим количеством эфира (-10 мл). Оставляли в холодильнике для кристаллизации. Для лучшей кристаллизации продукта добавляли затравку. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре небольшим количеством эфира. Сушили в эксикаторе.

Выход – 5,358 г (11,65 ммоль) 79,92%

Rf – 0,326(7); 0,947 (8); 0,390 (9)

Т.пл. 125-126°С

[]_D ²²=-101,18° (с=0,85; СН₃ОН).

Элементный анализ: С 62,89(62,73); N 9,21(9,14); Н 7,52(7,24).

IV. ТФА·H-Pro-Gly-Pro-OBzl. 5,358 г (11,65 ммоль) Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 29,13 мл хлористого метилена, добавляли 29,13 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход – 4,63 г (9,7 ммоль) 98%

Rf – 0,043 (7); 0,247 (8); 0,018 (9).

V. Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl. 3,09 г Boc-Arg(NO₂)-OH 9,7 ммоль растворяли в 50 мл ТГФ и 10 мл ДМФА, добавляли 2,07 г (10,67 ммоль) ДЦГК, охлаждали до 0°С, перемешивали в течение 40 минут и добавляли раствор ТФА·H-Pro-Gly-Pro-OBzl в 50 мл ТГФ и 4,46 мл (9,7 ммоль) ТЭА. Перемешивали реакционную смесь в течение трех суток. Отфильтровывали осадок ДЦМ, упаривали раствор в вакууме, к остатку приливали 200 мл гексана, при этом отделялся целевой продукт в виде масла, которое растворяли в 500 мл этилацетата и промывали 3 раза по 25 мл 0,1 н. HCl, 3 раза по 25 мл Н₂O, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и упаривали. Остаток растворяли в ЭА и высаждали сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме над P₂O₅/KOH и парафином, меняя несколько раз осушитель.

Выход – 4,76 г (7,9 ммоль) 85%

Rf – 0,44(1); 0,8 (11)

Т.пл. 108-110°С

[]_D ²² – 77,8° (с=0,5; СН₃СООН).

VI. Boc-Arg-Pro-Gly-Pro. 4,76 г (6,5 ммоль) Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 100 мл метанола, добавляли 1 мл 1 н. соляной кислоты и 4,67 г катализатора -10% окись палладия на нейтральной окиси алюминия, гидрировали в токе сухого водорода при комнатной температуре и давлении 1 атм в течение 6 часов. Затем катализатор отфильтровывали, промывали на фильтре метанолом. Объединенный фильтрат упаривали досуха. Остаток высаждали из абс. метанола эфиром. Сушили в вакууме, несколько раз меняя осушители.

Выход – 4,23 г (5,8 ммоль) 89%

Rf – 0,125 (4); 0,57 (6); 0,37 (5)

Т.пл. 123-125°С.

VII. Arg-Pro-Gly-Pro. 4,23 г (5,8 ммоль) Boc-Arg-Pro-Gly-Pro-OH суспензировали в 10 мл 2 н. соляной кислоты в диоксане и выдерживали при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем добавляли сухой эфир, выпавший осадок промывали декантацией сухим эфиром. Переосаждали из абсолютного метанола эфиром. Полученный осадок растворяли в 7,5 мл 30% этанола и наносили на колонку со смолой Амберлист А-21 (AcO^–-форма) для обмена хлористоводородной соли на ацетат. Элюировали пептид 200 мл 30% этанола, упаривали в вакууме досуха и высаждали из метанола абс. эфиром.

Выход – 3,69 г (4,93 ммоль) 85%

Rf – 0,287 (4); 0,145 (5); 0,338 (14)

Т.пл. 120-122°С.

Результаты ВЭЖХ: Колонка Supercosil ABZ+Plus размер 4,6×250 мм; скорость потока 1 мл/мин; Элюент A: NH₄H₂PO₄+Н₃PO₄ (50 mM, рН 2.8); элюент В: МеОН

Градиент: 0-20 мин (0-40%В); время выхода 21,21 мин.

Пример 2. Синтез пептида Phe-Pro-Gly-Pro

I. Boc-Pro-Gly.

А) 10,75 г (50 ммоль) Boc-Pro растворяли в 150 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С, к раствору прибавляли 7,7 мл (50 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли 6,8 мл (55 ммоль) пивалоил хлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор Gly. Одновременно приготавливали раствор Gly.

Б) Gly 4,5 г (60 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 35 мл воды и 60 мл ацетонитрила, прибавляли 8,4 мл (60 ммоль) триэтиламина, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали на роторном испарителе. К остатку добавляли ˜50 мл воды. Водный раствор подкисляли 3-х кратным избытком NaHSO₄ (24,84 г) до рН 3, экстрагировали 5 раз по 100 мл этилацетатом. Объединенный раствор этилацетата промывали Н₂О (50 мл), 10% раствором KHSO₄ (50 мл), H₂O (50 мл), насыщенным раствором NaCl (50 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. К остатку добавляли сухой эфир. При добавлении эфира в колбе выпадает продукт, который отфильтровывали, промывая его на фильтре сухим эфиром. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, P₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход – 5,97 г (21,74 ммоль); (43,5%)

Rf – 0,863 (2); 0,746) (3); 0,847 (7); 0,903 (8)

Т.пл. 70°С.

II. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl.

1) 5,97 г (21,74 ммоль) Boc-Pro-Gly растворяли в 100 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°C, к раствору прибавляли избыток 1,1 (3,35 мл; 23,9 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С, перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли избыток 1,1 (2,34 мл; 23,9 ммоль) пивалоил хлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор HCl·Pro-OBzl.

Одновременно приготавливали раствор HCl·Pro-OBzl.

2) HCl·Pro-OBzl 6,3 г (26,1 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 50 мл ацетонитрила, прибавляли 4,0 мл (28,71 ммоль; избыток 1,1) триэтиламина, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали. К упаренному остатку прибавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали Н₂O (3 раза по 25 мл), 10% раствором KHSO₄ (3 раза по 25 мл), Н₂О (3 раза по 25 мл), 5% раствором NaHCO₃ (3 раза по 25 мл), Н₂О (3 раза по 25 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 25 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. К остатку добавляли ˜100 мл сухого эфира. При добавлении эфира в колбе выпадает продукт, который отфильтровывали, промывая его на фильтре сухим эфиром. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, P₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход – 8,12 г (17,66 ммоль); (81,23%)

Rf – 0,620 (3); 0,326 (7); 0,947 (8); 0,390 (9); 0,716 (10)

Т.пл. 125-126°С.

Элементный анализ: С 62,89 (62,73); N 9,21 (9,14); Н 7,52 (7,237).

III. ТФА·Pro-Gly-Pro-OBzl. К 8,12 г (17,66 ммоль) Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl прибавляли 44,15 мл хлористого метилена и 44,15 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над P₂O₅/KOH и парафином.

Выход: 7,95 г (17,3 ммоль); 98%.

Rf – 0,043 (7); 0,247 (8); 0,018 (9)

IV. Boc-Phe-Pro-Gly-Pro-OBzl.

1) 3,89 г (14,68 ммоль) Boc-Phe растворяли в 100 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С к раствору прибавляли избыток 1,1 (2,26 мл; 16,15 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С, перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли избыток 1,1 (1,99 мл; 16,15 ммоль) пивалоил хлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор TOA·Pro-Gly-Pro-OBzl.

Одновременно приготавливали раствор ТФА·Pro-Gly-Pro-OBzl.

2) ТФА·Pro-Gly-Pro-OBzl. 8,12 г (17,66 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 50 мл ацетонитрила, прибавляли 4,94 мл (35,32 ммоль; 2-х кратный избыток до рН 8-9) триэтиламина, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали. К упаренному остатку прибавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали Н₂О (3 раза по 25 мл), 10% раствором KHSO₄ (3 раза по 25 мл), Н₂O (3 раза по 25 мл), 5% раствором NaHCO₃ (3 раза по 25 мл), Н₂O (3 раза по 25 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 25 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. Остаток растворяли ˜30 мл сухого эфира и высаждали гексаном. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, P₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход – 8,38 г (13,83 ммоль); (94,0%)

Rf – 0,890 (6); 0,540 (7); 0,731; (8)0,373 (9)

Т.пл. 87-88°С.

V. Boc-Phe-Pro-Gly-Pro. 8,38 г (13,83 ммоль) Boc-Phe-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 100 мл метанола, прибавляли 0,5 мл СН₃СООН и палладиевую чернь, перемешивая на магнитной мешалке пропускали водород в течение 2-х часов. Раствор отфильтровывали, упаривали, два раза упаривали с бензолом, один раз с этилацетатом, добавляли 10 мл этилацетата и заливали гексаном. Выпавший осадок отфильтровывали, промывая на фильтре гексаном. Полученный осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход – 6,37 г (12,72 ммоль); (92%)

Rf – 0,64 (12)

Т.пл. 101-103°С.

VI. Phe-Pro-Glv-Pro. К 6,37 (12,72 ммоль) Boc-Phe-Pro-Gly-Pro-OH прибавляли 19,1 мл 1 н. HCl/СН₃СООН выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитных групп раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, заливали гексаном. Гексан сливали, а полученный осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над P₂O₅/KOH и парафином. К высушенному осадку добавляли абс. этилацетат, упаривали на роторном испарителе, добавляли 10 мл абс. этилацетата и высаждали сухим эфиром. При добавлении эфира выпадает осадок, который отфильтровывали. Осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над Р₂O₅/КОН и парафином. Белый кристаллический порошок.

Выход – (12,27 ммоль) (96,5%).

Полученный осадок растворяли в 10 мл 30% этанола и наносили на колонку со смолой Амберлист А-21 (AcO^–-форма) для обмена хлористоводородной соли на ацетат. Элюировали пептид 200 мл 30% этанола, упаривали в вакууме досуха и высаждали из метанола абс. эфиром.

Выход – (10,67 ммоль) (87%).

Rf – 0,06 (1); (085) (5); (055) (11); (0,474) (13)

Т.пл. 149-150°С.

Результаты ВЭЖХ: Колонка Supercosil ABZ+Plus размер 4,6×250 мм; скорость потока 1 мл/мин; 20% МеОН, 80% NH₄H₂PO₄+Н₂PO₄ (50 mM, pH 2.8), время выхода 13,36 мин.

Пример 3. Синтез пептида Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro.

I. Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl получали по методике как описано в примере 1.

Выход – 4,76 г (7,9 ммоль) 85%

Rf – 0,44 (4); 0,8 (5)

Т.пл. 108-110°С

[]_D ²²=-77,8° (с=0,5; СН₃СООН).

II. TFA-Arg(NO₂)-Pro-Glv-Pro-OBzl. 4,76 г (7,9 ммоль) Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 20 мл хлористого метилена, добавляли 20 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход количественный.

Rf – 0,16 (4); 0,27 (5).

III. Boc-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Grv-Pro-OBzl. Boc-Pro 1,7 г (7,9 ммоль) растворяли в 20 мл ТГФ, добавляли 1,07 г (7,9 ммоль) ОБТ, охлаждали до 0°С и добавляли 1,8 г ДЦГК в 50 мл ТГФ. Через 40 мин к реакционной смеси добавляли раствор TFA-H-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl (7,9 ммоль) в 50 мл ТГФ и 1,1 мл (7,9 ммоль) ТЭА. Перемешивали 2 часа при 0°С и 2-е суток при комнатной температуре, затем отфильтровывали ДЦМ, упаривали в вакууме, растворяли в 500 мл ЭА и обрабатывали аналогично Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Выход 4,07 г (6,5 ммоль) 67,8%

Rf – 0,42 (4); 0,72 (5); 0,31(9)

Т пл. 147-148°С.

IV. TFA-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Glv-Pro-OBzl. Boc-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl 4,07 г (5,3 ммоль) растворяли в 14 мл хлористого метилена, добавляли 14 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над P₂O₅/KOH и парафином.

Выход – 3,94 г (5,2 ммоль) 97%

Rf – 0,095 (4); 0,246(2); 0,202(10)

V. Boc-Lvs(Z)-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

А) К Boc-Lys(Z)-OH 3,8 г (10 ммоль) в 25 мл абс. ЭА добавляли 2,26 г ДЦГК и 1,87 г пентафторфенола в 50 мл ТГФ, охлаждали до 0°С. Реакционную смесь перемешивали 2 часа при 0°С, отфильтровывали ДЦМ, раствор упаривали в вакууме, добавляли 25 мл абс. эфира и 75 мл гексана, постепенно при охлаждении отделялся осадок, который отфильтровывали и высушивали в вакууме.

Выход – 2,8 г (87%)

Rf – 0,84 (4); 0,91 (9)

Т.пл. 117-120°С.

Б) К TFA-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl 2,27 г (5,2 ммоль), растворенного в 50 мл ТГФ и охлажденного до 0°С, прибавляли при перемешивании 0,75 мл ТЭА и затем в течение 2 часов четырьмя порциями Boc-Lys(Z)-OPfp 2,8 г (5,2 ммоль).

Перемешивали 24 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали в вакууме, остаток растворяли в 300 мл ЭА и обрабатывали, аналогично Вос-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Выход – 3 г (3 ммоль) 58%

Rf – 0,38 (4); 0,75 (5)

Т.пл. 130-132°С

[a]_D ²²=-86,2° (с=0,5; СН₃СООН).

VI. Вос-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OBzl. 3 г (3 ммоль) Boc-Lys(Z)-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 100 мл метанола, добавляли 0,5 мл 1 н соляной кислоты и 3 г катализатора – 10% окись палладия на нейтральной окиси алюминия, гидрировали в токе сухого водорода при комнатной температуре и давлении 1 атм в течение 6 часов. Затем катализатор отфильтровывали, промывали на фильтре метанолом. Объединенный фильтрат упаривали досуха. Остаток высаждали из абс. метанола сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали, сушили в вакууме.

Выход – 2,67 г (2,67 ммоль) 89%.

VII. Lvs-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. 2,67 г (2,67 ммоль) Boc-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OBzl суспензировали в 5 мл 2 н соляной кислоты в диоксане и выдерживали при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем добавляли сухой эфир, выпавший осадок промывали декантацией сухим эфиром. Переосаждали из абсолютного метанола эфиром. Полученный осадок растворяли в 5 мл 30% этанола и наносили на колонку с Амберлистом А-21 (АсО^–-форма) для обмена хлористоводородной соли на ацетат. Элюировали пептид 100 мл 30% этанола, упаривали в вакууме досуха и высаждали из метанола абс. эфиром.

Выход – 1,54 г (2 ммоль) 75%

Rf – 0,24(6)

Т.пл.=151°С

[]_D ²²=-65,0° (с=0,5; СН₃СООН).

Результаты ВЭЖХ: Колонка Zorbax ODS d=4,6 mm; t=35°C скорость потока 1 мл/мин; A=50 mM NH₄Н₂PO₄ (рН 2,5); В=А+МеОН (1:1); 10-60% В (за 25 мин). Время выхода 16,5 мин.

Пример 4. Синтез пептида HCl Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro.

I. Z-Glu(OBu^t)-His-OMe. В колбе №1 13,5 г (40 ммоль) Z-Glu(OBu^t)-OH растворяли в 50 мл хлористого метилена, охлаждали до +5°С и добавляли 5,6 мл (40 ммоль) ТЭА. Реакционный раствор охлаждали до -25°÷-30°С. При этой температуре прибавляли из пипетки 5,30 мл (40 ммоль) изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты. Температуру реакции удерживали в интервале -18÷-20°С в течение 20 мин. Одновременно в колбе №2 готовили раствор 12,1 г (50 ммоль) 2HCl·H-His-OMe в 70 мл хлороформа, содержащего 14 мл (100 ммоль) ТЭА, и для полного растворения нагревали до 60°С. Раствор охлаждали до -25°С, и после образования смешанного ангидрида глутаминовой кислоты в колбе №1 ее содержимое приливали сразу к раствору эфира в колбе №2. Температура реакционной смеси повышается до -10°С, эту температуру поддерживали 1 час, затем раствор оставляли на 1 час в холодильнике и выдерживали при 20°С еще в течение 3-х часов. Реакционный раствор упаривали, добавляли 300 мл этилацетата, полученный раствор промывали 3 раза по 30 мл Н₂O, 3 раза по 30 мл 10% Na₂CO₃, 3 раза по 30 мл Н₂О, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, фильтровали и упаривали. При упаривании выпадает осадок, который отфильтровывали, промывали на фильтре гексаном, сушили в вакууме. Остаток растирали с гексаном, отфильтровывали, сушили.

Выход – 18,36 г (94%)

Rf – 0,213(1); 0,64(2); 0,495(3); 0,428(6)

Т.пл. 98-100°С [c=1; СН₃ОН).

II. Z-Glu(OBu^t)-His-N₂H₃. 18 г (37 ммоль) Z-Glu(OBu^t)-His-OMe растворяли в 25 мл метанола и добавляли 6,9 мл (138 ммоль) гидразин-гидрата, перемешивали на мешалке при 20°С 72 часа. Реакционную смесь упаривали. Кристаллизовали из 50% метанола, выпавший осадок промывали на фильтре небольшим количеством воды и эфиром, сушили в вакууме над Р₂O₅/КОН.

Выход – 13,7 г (76%)

Rf – 0,484 (2); 0,206 (3); 0,94 (5); 0,114 (6)

Т.пл. 145-147°С

[]_D ²²=-32,8° (с=1; СН₃ОН).

III. Z-Glu(OBu^t)-His-Phe-OMe. К охлажденному до -20°С раствору 8,8 г (18 ммоль) Z-Glu(OBu^t)-His-N₂H₃ в 50 мл ДМФА добавляли 15,5 мл (4 экв.) раствора хлористого водорода в этилацетате, 2,14 мл (18 ммоль) трет-бутилнитрита и перемешивали 30 мин при -5°С. Реакционную смесь охлаждали до -40°С и прибавляли охлажденный до -10°С раствор 4,34 г (18,9 ммоль) гидрохлорида метилового эфира фенилаланина в 30 мл ДМФА и 2,6 (18,9 ммоль) ТЭА. Выдерживали 72 часа при 4°С. Упаривали, добавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали Н₂O, 5% NaHCO₃, H₂O, 0,5% NH₄OH, Н₂О, насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, фильтровали и упаривали. Остаток растирали с гексаном.

Выход – 11,35 г (97%)

Rf – 0,356 (1); 0,68 (2); 0,245 (3)

Т.пл. 85-90°С

[]_D ²²=-31,30 (c=1; СН₃ОН).

IV. Z-Glu(OBu^t)-His-Phe-N₂H₃ получали из Z-Gl(OBu^t)-His-Phe-OMe аналогично синтезу соединения Z-Glu(OBu^t)-His-N₂Н₃.

Выход – 86%:

Rf – 0,25 (1); 0,582 (2); 0,204 (3)

Т.пл. выше 200°С

[]_D ²²=-31,3° (c=1; СН₃ОН).

V. Boc-Pro-Gly-OEt. Boc-Pro 8,3 г (38,45 ммоль) растворяли в 50 мл CH₂Cl₂, охлаждали до +5°С, добавляли 38,45 ммоль (5,38 мл) ТЭА. Реакционную смесь охлаждали до -25÷-30°С. При этой температуре из пипетки прибавляли 38,45 ммоль (4,84 мл) изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты. Температуру реакционной смеси удерживали в интервале -18÷-20°С 20 минут. Одновременно готовили раствор 5,9 г (42,3 ммоль) избыток 1,1 HCl·Н-Gly-OEt в 75 мл хлороформа, содержащего 5,92 мл ТЭА. Раствор охлаждали до -25°С и, после образования смешенного ангидрида в первой колбе, ее содержимое приливали сразу же к раствору эфира. Реакционную смесь выдерживали при температуре -10°С 1 час и затем при температуре +4°С 12 часов при перемешивании на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали, добавляли 250 мл этилацетата, раствор этилацетата промывали 3 раза по 25 мл 0,1 н HCl, 3 раза по 25 мл Н₂O, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, фильтровали и упаривали. Остаток высушивали в вакууме над Р₂О₅/КОН и парафином.

Выход – 10,2 г (30,3 ммоль), 78,83%

Rf – 0,5 (7); 0,862 (8); 0,719 (10).

VI. Boc-Pro-Gly-N₂H₃. Boc-Pro-Gly-OEt 10,2 г (30,3 ммоль) растворяли в 80 мл абсолютного метанола, добавляли 4-х кратный избыток гидразин-гидрата 5,88 мл (121,2 ммоль). Перемешивали 12 часов на магнитной мешалке при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, два раза упаривали с эфиром, остаток заливали эфиром (5 мл) и оставляли в холодильнике на ночь (для лучшей кристаллизации добавляли затравку). Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром, сушили в эксикаторе.

Выход – 6,9 г (20,79 ммоль), 68,62%

Rf – 0,284 (7); 0,474 (8); 0,189 (9); 0,427 (10)

Т.пл. 98-100°С.

VII. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl. К охлажденному до -20°С раствору Boc-Pro-Gly-N₂H₃ 4,7 г (14,6 ммоль) в 40 мл диметилформамида добавляли 58,4 ммоль (4-х кратный избыток) раствора хлористого водорода в этилацетате и сразу же 1,73 мл (14,6 ммоль) трет-бутилнитрита, реакционную смесь перемешивали 30 минут при -5°С. Реакционную смесь охлаждали до -40°С и добавляли охлажденный до -10°С раствор 8,2 мл (58,4 ммоль) ТЭА в 4 мл ДМФА; когда температура реакционной смеси повышалась до -20°С добавляли 3,7 г (15,3 ммоль) избыток 1,05 HCl·Н-Pro-OBzl в 20 мл ДМФА и 2,14 мл ТЭА. Выдерживали при 4°С 24 часа, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в 200 мл этилацетата и промывали 2 раза по 20 мл H₂O, 3 раза по 20 мл 10% KHSO₄, 3 раза по 20 мл H₂O, 3 раза по 20 мл 5% NaHCO₃, 3 раза по 20 мл Н₂О. Этилацетатный слой высушивали над MgSO₄. Упаривали, остаток заливали небольшим количеством эфира (10 мл). Оставляли в холодильнике. Для лучшей кристаллизации продукта добавляли затравку. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре небольшим количеством эфира. Сушили в эксикаторе.

Выход – 5,358 г (11,65 ммоль), 79,92%

Rf – 0,326 (7); 0,390 (9); 0,947 (8); 0,716 (10)

Т.пл. 125-126°С

[]_D ²²=-101,2° (c=0,85; СН₃ОН).

VIII. ТФА·Н-Pro-Gly-Pro-OBzl. 5,358 г (11,65 ммоль) Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 29,13 мл хлористого метилена, добавляли 29,13 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход – 4,63 г (9,7 ммоль), 98%

Rf – 0,043 (7); 0,247 (8); 0,018 (9).

IX. Z-Glu(OBu^t)-His-Phe-Pro-Gly-Pro-OBzl получали из соединений Z-Glu(OBu^t)-His-Phe-N₂H₃ и TFA-H-Pro-Gly-Pro-OBzl аналогично синтезу Z-Glu(OBu^t)-His-Phe-OMe.

Выход – 88%

Rf – 0,196(1); 0,605(3); 0,956(4)

Т.пл. 40°С (разл.)

[]_D ²²=-84,8° (c=1; СН₃ОН).

X. H-Glu(OBu^t)-His-Phe-Pro-Gly-Pro-OH. 12,28 г (12,8 ммоль) соединения Z-Glu(OBu^t)-His-Phe-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 20 мл смеси метанол-уксусная кислота-вода (6:1:1) и гидрировали над Pd-чернью 24 часа.

Pd-чернь отфильтровывали, раствор упаривали два раза с бензолом, два раза с абс. метанолом. Высаждали из абс. метанола этилацетатом.

Выход – 9,8 г (90%)

Rf – 0,340(4); 0,252(5)

Т.пл. 95-98°С (разд.)

[]_D ²²=-59,1° (c=1; CH₃OH).

XI. HCl·H-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro. Растворяли 12.28 г (12.8 ммоль) Н-Glo(OBu^t)-His-Phe-Pro-Gly-Pro-ОН в 19,2 мл 1 н HCl/СН₃СООН. выдерживали 45 минут при 20°С. Реакционную смесь высаждали из абс. эфиром, полученный осадок переосаждали из абс. метанола этилацетатом. Пептид отфильтровывали и сушили в вакууме над КОН, Р₂О₅ и парафином.

Выход – 11,7 г (95%)

Rf – 0,257(5)

Т.пл. 120°С (разл.).

Результаты ВЭЖХ: Колонка Supercosil ABZ+Plus размер 4,64250 мм: скорость потока 1 мл/мин: 20% МеОН, 80% NH₄H₂PO₄+H₃PO₄ (50 mM, рН 2,8), время выхода 7,98 мин.

Пример 5.

Готовят растворы пептидов: 1 мг пептида растворяют в 2,5 мл физиологического раствора. При нанесении на пластины нестабилизированного фибрина по 0,03 мл растворов пептидов установлено наличие фибринолитической активности неферментативной природы. Зоны лизиса составляли 25-36 мм², в то время как в контрольных пробах (с NaCl без пептидов) зоны лизиса не обнаруживались. При добавлении 0,1 мл раствора пептидов к 0,2 мл плазмы крови здоровых крыс выявлено наличие у пептидов антикоагулянтной активности (по тесту АЧТВ время образования фибринового сгустка удлинялось в 1,3-1,4 раза по сравнению с контрольным раствором NaCl). Далее препараты пептидов вводят внутривенно в v.jugularis 5-ти лабораторным белым крысам по 0,5 мл (200 мкг) на 200 г массы тела. Контрольным животным тем же способом вводят 0,85% раствор NaCl, в объеме 0,5 мл на 200 г массы тела. Через 10 мин берут кровь и центрифугируют ее при 1000 об/мин в течение 5 мин для получения богатой тромбоцитами плазмы (для анализа агрегации тромбоцитов), затем дополнительно центрифугируют кровь в течение 10 мин при 2000 об/мин и получают плазму, бедную тромбоцитами.

В богатой тромбоцитами плазме агрегация тромбоцитов в опытных пробах составляла 65%, в то время как в контроле – 100%, т.е. препараты пептидов обладают антитромбоцитарной активностью при введении в кровоток.

Пример 6.

Берут препараты пептидов по 1 мг, растворяют каждый в 2,5 мл физиологического раствора и вводят внутривенно белым крысам в v.jugularis в дозе 200 мкг/ 200 г массы тела. Далее поступают так, как описано в примере 5. В бедной тромбоцитами плазме обнаружено увеличение активности активатора плазминогена в 2,1 раза, общей фибринолитической активности – в 1,6 раза, антикоагулянтной активности – в 1,5 раза, неферментативной фибринолитической активности – в 1,7 раза по сравнению с контролем (физиологическим раствором). Следовательно, пептиды обладают антикоагулянтно- фибринолитической активностью при введении в кровоток.

Пример 7.

Берут препараты пептидов по 1 мг, растворяют каждый в 2,5 мл физиологического раствора и вводят интраназально в течение 5 дней через каждые 24 часа 5-ти лабораторным крысам по 0,5 мл на 200 г массы тела. Контрольным животным тем же способом вводят 0,85% раствор NaCl. Через 5 дней после последнего введения в изолированном зажимами участке v.jugularis (стаз) с помощью тромбина путем его внутривенного введения в дозе 0,5 мг/0,5 мл вызывают образование тромба и определяют через 1 час вес образовавшихся тромбов и измеряют в мг. Показано, что у животных, предварительно получавших пептиды, тромбы или не образовывались, или их вес был небольшим – менее 0,4 мг, в то время как у контрольных животных вес тромбов составлял выше 1,7 мг. Следовательно, пептиды обладают антитромботической активностью, предупреждая процессы тромбообразования в кровотоке.

Таким образом, все исследованные пептиды обладают антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной и антитромботической активностью, что продемонстрировано в сводной таблице 1.

Следовательно, заявленные пептиды, обладающие антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной, антитромботической активностью, имеют преимущества перед известными пептидами, продуктами расщепления фибриногена, применение которых в клинике не описано и которые обладают только антитромботической и антитромбоцитарной активностью в крови.

В таблице 2 представлены данные, свидетельствующие о преимуществе заявленных пептидов общей формулы Х-Pro-Gly-Pro, где Х=Phe-; Arg-; Lys-Pro-Arg-; Glu-His-Phe- no сравнению с эталонными препаратами комплекса гепарин-фибриноген и три- и тетрапептидами (Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly).

Таким образом, из таблицы 2 видно, что заявленные пептиды имеют преимущество перед эталонными препаратами комплекса фибриноген-гепарин и пептидами Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly по степени увеличения антикоагулянтно-фибринолитической активности и снижения агрегации тромбоцитов в условиях in vitro; при внутривенном введении антикоагулянтно-фибринолитические эффекты заявленных пептидов превышают те же активности эталонного тетрапептида Gly-Pro-Gly-Gly; при интраназальном введении антитромботические эффекты заявленных пептидов превышают подобное действие комплекса фибриноген-гепарин и тетрапептида Gly-Pro-Gly-Gly.

Формула изобретения

Пептиды общей формулы:

X-Pro-Gly-Pro, где

X=Phe-,

Arg-,

Lys-Pro-Arg-,

Glu-His-Phe-;

обладающие антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной и антитромботической активностью.