Патент на изобретение №2285041

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КРАБА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в парфюмерно-косметической промышленности, кожевенном производстве, меховом производстве, химико-фармацевтической промышленности. Способ предусматривает выделение фермента из замороженного гепатопанкреаса краба посредством автолиза. Автолиз осуществляют в растворе деионизированной воды температурой не выше 21°С, при соотношении гепатопанкреас краба : деионизированная вода 1:4 соответственно и периодическом перемешивании в течение 14-15 ч. Полученную смесь фильтруют при температуре не выше 21°С под давлением через сито с размером ячей 5 мм, затем через фильтрующие устройства с размером пор 1,5 и 0,1 мм соответственно. К полученному фильтрату сначала добавляют раствор пищевой соды и перемешивают 5 мин. Затем к полученной смеси добавляют раствор аскорбата хитозана, температурой не выше 21°С, при общем соотношении частей фильтрат : раствор пищевой соды : раствор аскорбата хитозана 1,25:0,15:1 соответственно. Смесь перемешивают в течение 10-15 мин. Выдерживают в течение 1,5 ч до расслоения на белковую и липидную фракции. Белковую фракцию направляют на последовательную микрофильтрацию, затем ультрафильтрацию с охлаждением фильтрата до 12°С. Ультрафильтрацию проводят в замкнутом цикле при подаче деионизированной воды и поддержании соотношения белкового раствора и деионизированной воды 2:1. Изобретение позволяет упростить процесс получения ферментного препарата, дает возможность его легко автоматизировать, повысить экологичность процесса. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения ферментного препарата, предназначенного для применения в парфюмерно-косметической и химико-фармацевтической промышленности, а также в кожевенном и меховом производстве.

В настоящее время известно достаточно много способов получения ферментов из гепатопанкреаса краба (Пат. РФ 1699350, 2034028, 2039819, 2096456, 2112036, 2121503, 2132876, 2225441, заявка на получение патента РФ №2003106162/13).

Это обусловлено тем, что гепатопанкреас краба, особенно камчатского, очень богат протеолитическими ферментами, в т.ч. коллаганазами и при этом является доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью (Пат. РФ 2096456, МКИ 6 С 12 N 9/48, 9/64. Способ получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью / Изобретатели-патентообладатели: В.Л.Стадников и С.М.Ерхов. – №96121409/13; заявл. 11.01.1996. Опубл. 20.01.1998. Бюл.№2 (ч.1)).

Способ предусматривает выделение фермента при температуре не выше 21°С из замороженного гепатопанкреаса краба экстракцией в присутствии раствора хлорида щелочного металла выдержкой в 0.1-1.0 М в соотношении 1:2.2-2.3 при периодическом помешивании в течение 14-16 ч и температуре 19-21°С, отделение осадка и липидов, очистку последовательной фильтрацией, микрофильтрацией с размером пор 0,5 мм и 0,1 мм и ультрафильтрацией с лимитом пропускания 10 кДа, затем лиофильную сушку конечного продукта.

Для выпуска продукции указанным способом на стадии выделения ферментов и отделения липидов (жировой фракции) используется дорогостоящая и дефицитная аппаратура. Продукт можно получить более малозатратным способом.

Заявляемый способ получения ферментного препарата предусматривает выделение фермента при температуре не выше 21°С из замороженного гепатопанкреаса краба посредством автолиза, который осуществляют в растворе деионизированной воды при соотношении гепатопанкреас краба : деионизированная вода 1:4 и периодическом перемешивании в течение 14-15 ч. Этого времени достаточно для полного автолиза и гомогенизации мороженого гепатопанкреаса до однородного состояния в растворе за счет эндопротеаз.

Полученную смесь фильтруют при температуре не более 21°С путем последовательного пропускания под давлением сначала через сито с ячеей 5 мм для отделения нерастворимого материала, затем через фильтрующие устройства (например, стрейнеры) с размером пор соответственно 0,5 мм и 0,1 мм.

Полученный фильтрат под давлением направляют в емкость для флокуляции – для отделения липидов (жировой фракции) и осветления раствора.

Сначала к фильтрату добавляют заранее приготовленный раствор пищевой соды и для осаждения липидов перемешивают смесь в течение 5 мин, а затем к полученной смеси добавляют приготовленный раствор аскорбата хитозана температурой не выше 21°С, при общем соотношении частей фильтрат : пищевая сода : аскорбат хитозана соответственно 1,25:0,15:1.

Смесь активно перемешивают в течение 10-15 мин, а по окончании этого процесса выдерживают в течение 1,5 ч до расслоения на белковую и липидную фракции.

Раствор пищевой соды готовят в соотношении массы компонентов на 100 кг готового раствора, кг:

при этом температура раствора не превышает 21°С.

Раствор аскорбата хитозана готовят в соотношении массы компонентов на 100 кг готового раствора, кг:

при этом температура раствора не превышает 21°С.

В предложенном способе отделение липидной фракции из смеси осуществляют путем введения в раствор активных флокулянтов, обеспечивающих высокую степень очистки белкового раствора без применения дефицитного дорогого и сложного устройства.

Степень очистки имеет большое значение, так как отсутствие липидов в готовом продукте существенно сказывается на его стабильности (продукт длительное время не портится, т.к. не происходит окисления липидов) и на эффективности проведения процесса ультрафильтрации (дорогостоящие и «капризные» рабочие мембраны не выходят из строя).

Липидную фракцию механически отделяют и направляют на консервацию.

Белковую фракцию под давлением направляют в емкость с фильтрующим приспособлением с размером ячеи 0,1 мм (например, бязевый мешок) на микрофильтрацию и далее через фильтрующее устройство с размером пор 0,1 мм – в систему ультрафильтрации, оснащенную системой охлаждения.

Ультрафильтрацию осуществляют после охлаждения полученного фильтрата до 12°С (например, с помощью водяной рубашки), при этом процесс очистки от примесных веществ ведут в замкнутом цикле через мембраны с размером пор 10 кДа, при подаче деионизированной воды для поддержания соотношения белкового раствора и деионизированной воды соответственно 2:1 с целью предотвращения преждевременной концентрации раствора и более полного удаления низкомолекулярных соединений, что позволяет собрать фермент, не проходящий через мембрану.

После окончания процесса ультрафильтрации раствор, имеющий ферментную активность, концентрируют и концентрат (жидкость коньячного цвета) направляют на сушку известным способом (например, на лиофилизацию или распылительную сушку) для получения готового продукта – ферментного препарата.

Полученный препарат – пылеобразный однородный порошок бежевого цвета – имеет коллагенолитическую, протеолитическую, эстеразную, пептидазную, эластазную, ДНКазную, липазную, амидазную и хитиназную активность.

Изобретение позволяет осуществить простой, легко автоматизируемый и экологически чистый процесс выделения комплекса ферментов из крабов без применения органических растворителей, при небольших затратах материалов, технологического времени и сырья.

Пример осуществления способа.

В помещении с температурой воздуха не выше 25°С 30 кг мороженого в брикетах гепатопанкреаса краба разделили на несколько частей и поместили в бак №1 из нержавеющей стали, с расположенным внизу сливным отверстием и металлическим ситом с ячеей 5 мм на дне.

В бак №1 добавляли деионизированную воду температурой не выше 21°С до соотношения гепатопанкреаса и деионизированной воды по массе 1:4 и посредством автолиза выделяли комплекс ферментов из замороженного гепатопанкреаса краба при температуре не выше 21°С и периодическом перемешивании в течение 15 ч.

За это время были достигнуты полный автолиз и гомогенизация гепатопанкреаса краба до однородного состояния в растворе.

Деионизированную воду производили на установке для очистки воды «Шарья М 500».

Все устройства системы были соединены между собой гибкими шлангами из полимерного материала. Для создания давления при фильтрации использовали перистальтические насосы со скоростью вращения 30-35 об/мин.

Полученную смесь фильтровали при температуре не более 21°С путем последовательного пропускания под давлением сначала через сито с ячеей 5 мм бака №1 для отделения нерастворимого материала (остатка), затем через фильтрующее устройство (емкость) – стрейнер №1 с размером пор 0,5 мм в бак №2.

Фильтрат из бака №2 под давлением пропускали через стрейнер №2 с размером пор 0.1 мм в бак №3 с расположенным внизу сливным отверстием.

В баке №3 к фильтрату сначала добавляли заранее приготовленный раствор пищевой соды температурой не выше 21°С и непрерывно перемешивали смесь в течение 5 мин для осаждения липидов, затем добавляли приготовленный раствор аскорбата хитозана температурой не выше 21°С при общем соотношении частей фильтрат : пищевая сода : аскорбат хитозана соответственно 1,25:0,15:1 для отделения липидов (жировой фракции) и осветления раствора.

Раствор пищевой соды готовили в соотношении массы компонентов на 100 кг готового раствора, кг:

при этом температура раствора не превышала 21°С.

Раствор аскорбата хитозана готовили в соотношении массы компонентов на 100 кг готового раствора, кг:

при этом температура раствора не превышала 21°С.

Смесь 15 мин перемешивали и по окончании этого процесса выдерживали до расслоения на белковую и липидную фракции в течение 1,5 ч.

По окончании процесса флокуляции липидную фракцию механически отделяли в пластиковые мешки и направляли на консервацию, а белковую фракцию под давлением направляли в накопительный бак №4 из нержавеющей стали с расположенным внизу сливом.

Перед началом работы в бак №4 вставляли и закрепляли крышкой бака приспособление для микрофильтрации – бязевый мешок с размером ячеи 0,1 мм, через который осуществляли микрофильтрацию белкового раствора.

Далее соединяли сливной кран накопительного бака №4 и входное отверстие стрейнера №2 с размером пор 0,1 мм. Фильтровали белковый раствор через бязь и стрейнер №2 и направляли в бак №5 системы ультрафильтрации, снабженный системой охлаждения (водяной рубашкой).

Перед поступлением белкового раствора в бак №5 включали систему охлаждения путем подачи воды на водяную рубашку.

Контролировали количество поступающего в бак фильтрата. После того, как его объем достиг 2/3 объема бака, фильтрат охлаждали до 12°С и открывали клапаны подачи раствора на фильтры системы. Процесс очистки шел автоматически. Раствор циркулировал в системе по замкнутому циклу, проходя через мембраны из регенеративной целлюлозы с размером пор 10 кДа.

Во время цикла для предотвращения преждевременной концентрации раствора и более полного удаления низкомолекулярных соединений в бак №5 с белковым раствором подавали порциями деионизированную воду.

В целом соотношение частей белкового раствора и деионизированной воды составляло соответственно 2:1. После окончания подачи воды концентрировали ферментный комплекс и отправляли его на лиофилизацию.

Объем концентрата, имеющего коньячный цвет, составил 5% от общего объема жидкости, поступившей в бак №5. Липиды отсутствовали.

Концентрат помещали в лотки из нержавеющей стали по 0,5-0.6 л в каждый. Лиофилизацию вели 48 ч.

Вес готового продукта – ферментного препарата, обладающего коллагенолитической, протеолитической, эстеразной, пептидазной, эластазной, ДНКазной, липазной, амидазной и хитиназной активностью, составил 380 г.

Препарат имел вид пылеобразного однородного порошка бежевого цвета, влажность которого составляла не более 10%.

Изобретение позволяет осуществить простой, легко автоматизируемый и экологически чистый процесс выделения комплекса ферментов из крабов без применения органических растворителей, при небольших затратах материалов, технологического времени и сырья.

Формула изобретения

1. Способ получения ферментного препарата, предусматривающий выделение фермента из замороженного гепатопанкреаса краба при температуре не выше 21°С, отделение осадка и липидов, очистку последовательной фильтрацией и микрофильтрацией через фильтры с размером пор 0,5 и 0,1 мм и ультрафильтрацией с лимитом пропускания 10 кДа, лиофильную сушку целевого продукта, отличающийся тем, что выделение фермента ведут посредством автолиза в растворе деионизированной воды при соотношении 1:4 соответственно и периодическом перемешивании в течение 14-15 ч до полного автолиза и гомогенизации гепатопанкреаса краба в растворе, полученную смесь фильтруют под давлением через сито с ячеей 5 мм, в полученный фильтрат для отделения липидов и осветления добавляют раствор пищевой соды, перемешивают в течение 5 мин, к полученной смеси добавляют раствор аскорбата хитозана температурой не выше 21°С при общем соотношении частей фильтрат : пищевая сода : аскорбат хитозана 1,25 : 0,15 : 1 соответственно смесь перемешивают в течение 10-15 мин, затем выдерживают в течение 1,5 ч до расслоения на белковую и липидную фракции, белковую фракцию направляют на последовательную микрофильтрацию, затем ультрафильтрацию с охлаждением фильтрата до 12°С, при этом ультрафильтрацию ведут в замкнутом цикле при подаче деионизированной воды и поддержании соотношения белкового раствора и деионизированной воды 2 : 1.

2. Способ получения ферментного препарата по п.1, отличающийся тем, что раствор пищевой соды готовят в соотношении массы компонентов на 100 кг готового раствора, кг:

при этом температура раствора не превышает 21°С.