Патент на изобретение №2285038

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЙ ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для производства бактерийных ферментных препаратов. Изобретение предусматривает использование штамма Bacillus subtilis P1, культивируемого на питательной среде, содержащей минеральные соли, микроэлементы, мочевину и очищенный дрожжевой экстракт. Супернатант отделяют от биомассы методом сепарации с последующим осветлением микрофильтрацией и очисткой фермента ультрафильтрацией. Стерилизацию ферментного препарата осуществляют стерилизующей фильтрацией. Изобретение обеспечивает получение протеолитического фермента с высоким выходом и высокой удельной активностью для медицинского использования. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для производства бактерийных ферментных препаратов.

Известные способы культивирования бактерий рода Bacillus являются основой для технологии получения ряда бактериальных и ферментных препаратов. Ферментные препараты с различной активностью выделяют из культуральных жидкостей, полученных при гомогенном глубинном культивировании различных штаммов бактерий рода Bacillus [1, 2].

Известен способ получения очищенного препарата протеолитического фермента, получаемого микробиологическим путем, включающий наряду с культивированием депигментацию культуральной жидкости и очистку протеолитического фермента от балластных белков ионообменной хроматографией, при этом получают препарат протеолитического фермента с удельной активность, превышающей 20 ПЕ/мг белка [3].

Наиболее близким по техническому решению к заявленному является способ получения протеолитических ферментов путем использования антагонистически активного штамма Bacillus subtilis 3Н [4]. Способ включает глубинное гомогенное культивирование продуцента при посевной дозе (3-9)×10⁹ кл/мл, насыщении среды кислородом в пределах 70-90%. Культуральную жидкость отделяют от биомассы микрофильтрацией, концентрирование фермента осуществляют ультрафильтрацией, стерилизацию ферментного препарата осуществляют стерилизующей фильтрацией. Активность получаемого фермента составляет (50±5) ПЕ/г.

Однако протеолитический фермент, описанный как металлопротеаза, содержит в своем составе примеси сериновой протеазы. И несмотря на использование зарубежного фильтрационного оборудования в примерах 2, 3 удельная активность протеазы остается на низком уровне и составляет 2,5-3,2 ПЕ/мг белка [5]. Низкий уровень удельной активности, а также некоторая биологическая токсичность получаемой протеазы ограничивают сферы его применения.

Задачей настоящего изобретения является создание технологии, позволяющей получать препарат протеолитического фермента с высоким выходом и высокой удельной активностью для медицинского использования.

Поставленная задача решается подбором производственного штамма, условий его культивирования, а также оптимизацией способа выделения и очистки ферментного препарата.

Сущность изобретения заключается в использовании штамма Bacillus subtilis P1, культивируемого на питательной среде, содержащей минеральные соли, микроэлементы, мочевину и очищенный дрожжевой экстракт. Супернатант отделяют от биомассы методом сепарации с последующим осветлением микрофильтрацией, очистку фермента осуществляют ультрафильтрацией, стерилизацию ферментного препарата осуществляют стерилизующей фильтрацией.

Штамм продуцент Bacillus subtilis P1 представляет собой грамположительные палочки с размерами клеток (7-1,3)×(0,5) мкм, расположенные отдельно или небольшими цепочками, образующие внутренние центральные споры овальной формы, растущие на различных питательных средах, обладает подвижностью, оптимальные условия роста при температуре 37°С и рН 6,0-7,5 [6].

Очищенный дрожжевой экстракт получают освобождением от высокомолекулярных белков.

Совокупность заявленных существенных признаков обеспечивает получение ферментного препарата с высокой удельной активностью и высоким выходом конечного продукта.

Полученный препарат протеолитического фермента представляет собой металлопротеазу, обладающую активностью в отношении казеина, желатины, коллагена, бычьего сывороточного альбумина, яичного альбумина, трипсина, пепсина, оптимум рН 7,0-10,0, температуры 52°С и молекулярной массой 29 кД. При тестировании препарата протеолитического фермента подтверждено отсутствие примесей сериновой протеазы, а также примесей амилазы и липазы в составе ферментного препарата. Ферментный препарат представляет собой лиофилизированный порошок или пористую массу, уплотненную в таблетку серовато-белого цвета с удельной активностью не менее 20 ПЕ/мг белка и с активностью в одной дозе не менее 20 ПЕ;

Определение протеолитической активности проводят по гидролизу 1% раствора казеина. За единицу протеолитической активности (ПЕ) принимают такое количество фермента, которое за 10 мин повышает в неосаждаемых ТХУ продуктах протеолиза оптическую плотность раствора при 280 нм на 1 единицу.

Решение поставленной задачи иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Посевной материал объемом 100 мл вносят в биореактор “Биор-100” до конечной концентрации 0,01×10⁹ кл/мл, заполненный 72 л питательной среды следующего состава (г): калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный – 21,6; аммоний сернокислый – 144; натрий лимоннокислый 5,5-водный – 144; медь сернокислая 5-водная – 0,36; цинк сернокислый 7-водный – 0,288; железо (II) сернокислое 7-водное – 0,036; кальций хлористый – 11,88; марганец (II) сернокислый 5-водный – 3,6; магний сернокислый 7-водный – 21,6; d-мальтоза для бактериологических целей – 5; мочевина – 360; очищенный дрожжевой экстракт – 10800 мл, рН среды 7,0±0,2. Выращивание проводят при температуре 37°С, давлении подаваемого воздуха 0,2 кгс/см², перемешивании со скоростью вращения мешалки 300 об/мин, в течение 28 ч до перехода культуры в стационарную фазу роста и прекращения нарастания протеолитической активности культуральной жидкости.

Полученная таким способом культуральная жидкость обладает протеолитической активностью на уровне (15±5) ПЕ/мл, а количество микробных клеток составляет (15±3)×10⁹ кл/мл.

Ферментсодержащую культуральную жидкость отделяют от микробных клеток сепарацией, а затем осветляют микрофильтрацией. После отделения микробных клеток потери протеолитической активности составляют не более 2%.

Освобожденную от клеток культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации на мембранах с пределом отсечения 10 кД. Протеолитическая активность очищенного фермента составляет (140±10) ПЕ/мл, а удельная активность составляет (50±5) ПЕ/мг белка.

Пример 2.

Посевной материал объемом 200 мл вносят в биореактор “Биор-100”, до конечной концентрации 0,03×10⁹ кл/мл, заполненный 72 л питательной среды того же состава. Выращивание проводят при температуре 37°С, давлении подаваемого воздуха 0,4 кгс/см², перемешивании со скоростью вращения мешалки 400 об/мин, в течение 24 ч до перехода культуры в стационарную фазу роста и прекращения нарастания протеолитической активности культуральной жидкости.

Полученная таким способом культуральная жидкость обладает протеолитической активностью на уровне (15±5) ПЕ/мл, а количество микробных клеток составляет (15±3)×10⁹ кл/мл.

Ферментсодержащую культуральную жидкость отделяют от микробных клеток сепарацией, а затем осветляют микрофильтрацией. После отделения микробных клеток потери протеолитической активности составляют не более 2%.

Освобожденную от клеток культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации на мембранах с пределом отсечения 15 кД. Протеолитическая активность очищенного фермента составляет (140=10) ПЕ/мл, а удельная активность составляет (50±5) ПЕ/мг белка.

Пример 3.

Для подтверждения того, что по примерам 1, 2 получена металлопротеаза, проведен ингибиторный анализ. В качестве ингибиторов выбраны специфический ингибитор металлопротеаз – хелатирующий агент (этилендиаминтетраацетат) и специфический ингибитор сериновых протеаз (диизиропилфторфосфат) [7]. Результаты экспериментов представлены в таблице.

Таким образом, ингибиторный анализ полученного по примерам 1 и 2 протеолитического фермента показал, что протеаза полностью ингибируется хелатирующим агентом (этилендиаминтетрауксусной кислотой) при 10 мМ концентрации и не ингибируется ингибитором щелочных протеаз (диизопропилфторфосфатом), что свидетельствует о присутствии только металлопротеазы.

Полученный по примерам 1, 2 очищенный протеолитический фермент разбавляют 1 mM раствором хлористого кальция до концентрации протеолитического фермента не менее 20 ПЕ/мл, добавляют аминоуксусную кислоту в концентрации 20 г/л, стерилизуют фильтрацией через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм, разливают в ампулы по 1 мл и лиофилизируют.

Исследование токсикологической безвредности полученного препарата проводят в соответствии с “Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия фармакологических средств”, утвержденными МЗ РФ29.12.97 [8].

При определении параметров токсичности объектом исследования служит лекарственная форма препарата протеолитического фермента, полученная заявляемым способом. Препарат растворяют ex tempore в воде для инъекций в необходимой концентрации.

Острую токсичность определяют на белых беспородных мышах и крысах обоего пола массой 18-20 и 170-210 г соответственно. Препарат вводят однократно, мышам – внутрибрюшинно и подкожно, крысам – внутримышечно.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что исследуемый препарат протеолитического фермента является малотоксичным.

Субхроническую токсичность препарата изучают на белых аутбредных крысах обоего пола и мышах при подкожном введении в 2-х дозах – терапевтической и 10-кратной. Контрольные группы животных получают адекватно подкожно воду для инъекций. Проведено 20 ежедневных инъекций. Наблюдение за животными осуществляют при проведении инъекций и в течение 7 суток по окончании инъекций.

Перед началом и в конце опыта оценивают общее состояние животных, определяют массу тела, состав и свойства периферической крови, функции сердечно-сосудистой и центральной нервной систем, почек и печени. Животных умерщвляют декапитацией и определяют весовые коэффициенты внутренних органов. Определяют относительные коэффициенты массы внутренних органов.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что препарат при длительном введении животным не обладает токсическим действием, препятствующим его применению в качестве лекарственного препарата.

Для определения биологической активности препарат, полученный по заявляемому способу, изучают на предмет раноочищающего и ранозаживляющего действия на модели плоскостных полнослойных кожных ран [9, 10].

Фермент, получаемый по способу, взятому за прототип [4], не использовался в качестве препарата сравнения вследствие выявленной токсичности.

Работа проведена на 28 белых беспородных крысах (самках) массой 180-200 г. В качестве препарата сравнения используют лекарственное средство коллагеназу КК [11]. После предварительной обработки депилированного участка кожи животных в области холки под легким эфирным наркозом иссекают участок кожи с подкожной клетчаткой площадью 400 мм². На следующие сутки после формирования раны крыс делили на 4 группы по 7 голов в каждой:

1 – контроль (обработка раны стерильным физиологическим раствором);

2 – обработка раны раствором протеолитического фермента с активностью 10 ПЕ/мл;

3 – обработка раны раствором протеолитического фермента с активностью 20 ПЕ/мл;

4 – обработка раны раствором коллагеназы КК с активностью 20 ПЕ/мл.

Животные всех групп находились в стандартных условиях вивария, каждая крыса содержалась в отдельной клетке. Весовая оценка площади раневой поверхности проводилась на 1, 3, 5, 8, 12 и 15 сутки эксперимента [9, 12]. Интенсивность процессов раноочищения изучали макроскопически по состоянию раневой поверхности (качество грануляционной ткани, скорость отхождения струпа). О ранозаживляющем действии протеолитического фермента судили по динамике уменьшения площади раневой поверхности.

Достоверность различий средних групповых значений признаков оценивали по критерию Стьюдента, х² [13].

Полученные данные свидетельствуют, что с самого начала лечения в опытных группах раны были покрыты более нежной грануляционной тканью по сравнению с контролем, в котором грануляционная ткань, покрывающая рану, отличалась значительно более грубой консистенцией, большей толщиной и наличием трещин. Уже на 5 сутки лечения у животных группы 3 все струпья начали отходить (у одного животного – полностью, у остальных – частично). В группах 2 и 4 также наблюдалось отхождение струпьев в более ранние сроки по сравнению с группой 1.

Таблица 2
Раноочищающее и ранозаживляющее действие протеолитического фермента и коллагеназы КК (Х±т).
Группы животных	Срок наблюдения, сут	Состояние грануляционной ткани	Отхождение струпьев (кол-во животных)		Полное заживление (кол-во животных)
			Полное	частичное
1	5	толстые, грубые струпья	–	–	–
	8	толстые, грубые струпья с трещинами	1	4	–
	12	то же	4	2	–
	15	струпьев нет	6	–	1
2(10 ПЕ/мл)	5	струпья нежные	–	–	–
	8	то же	4	3	–
	12	то же	5	2	–
	15	струпьев нет	2	–	5
3(20 ПЕ/мл)	5	струпья нежные	1	6	–
	8	то же	5	2	–
	12	то же	6	1	–
	15	струпьев нет	1	–	6 (*Р<0,05)
4(коллагеназа КК)	5	струпья нежные	–	3	–
	8	то же	1	5	–
	12	то же	7	–	–
	15	струпьев нет	4	–	3
Примечание: *- достоверно по сравнению с контролем.

Как следует из результатов, приведенных в таблице, наиболее выраженное ранозаживляющее действие оказывал раствор протеолитического фермента 20 ПЕ/мл. Уже на 3 сутки исследования наблюдалось ускорение заживления кожной раны на 19,2%, тогда как у животных контрольной группы размеры раны были на 4,7% меньше по сравнению с исходным фоном. Протеолитический фермент с активностью 10 ПЕ/мл и коллагеназа КК оказывали менее выраженное ранозаживляющее действие (размер кожной раны уменьшался соответственно на 12,5 и 14,6% по сравнению с исходным фоном). Аналогичная тенденция сохранялась на протяжении всего срока наблюдения. Уже на 15 сутки наблюдалось практически полное заживление раневой поверхности у животных группы 3, у крыс в группах 1, 2, 4 незажившими оставалось 15,4; 3,8 и 6,4% площадей поверхности ран соответственно.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать вывод, что заявляемый протеолитический фермент в разных концентрациях обладает выраженным раноочищающим действием и ранозаживляющей активностью плоскостной раны в эксперименте.

Источники информации

1. А.с. СССР №899646, кл. С 12 N 9/54, 23.01.82. Способ получения щелочной протеазы.

2. Патент DE №3834550, кл. С 12 N 9/54, 19.04.90. Протеолитический фермент, его получение и применение.

3. А.с. СССР №860523, кл. С 12 N 9/62, 02.04.80. Способ получения протеолитического ферментного препарата Террилитина.

4. Патент РФ №2112035, кл. С 12 N 9/56, 23.01.97. Способ получения протеолитических ферментов из бактерий рода Bacillus.

5. Холодная Ж.В. Разработка технологии получения протеолитического ферментного комплекса из бактерий рода Bacillus. Дис… канд. биол. наук. – Уфа, 1999. – 139 с.

6. Патент РФ №2208633 С 12 N 9/56, 20.07.03. Штамм Bacillus subtilis PI – продуцент протеазы.

7. Харвуд К. Бациллы. Генетика и биотехнология. – М.: Мир, 1992, 472 с.

8. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств. Утверждены МЗ РФ 29.12.97.

9. Воспроизведение заболеваний у животных для экспериментально-терапевтических исследований. Л.: Медгиз. – 388 с.

10. Коллагенопластика в медицине. Под ред. Кованова В.В. и Сыченкова И.А., М. – 1978.

11. Патент RU 2093166 С1, кл. А 61 К 35/39, 20.10.97. Ранозаживляющее средство Коллагеназа КК широкого спектра действия.

12. Стручков В.И., Григорян А.В., Гостищев В.К. Гнойная рана. М. – 1975. – 311 С.

13. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. – Л. – 1963. – С.81-106.

Формула изобретения

1. Способ получения протеолитического ферментного препарата, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма на жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли, микроэлементы и органический источник азота, отделение ферментсодержащей жидкости от биомассы микрофильтрацией с последующей ультрафильтрацией и стерилизующей фильтрацией целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Bacillus subtilis P1, в качестве источника азота – мочевину и очищенный от высокомолекулярных белков дрожжевой экстракт, а отделение ферментсодержащей жидкости от биомассы перед микрофильтрацией проводят сепарированием.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что мочевину вводят в питательную среду до конечной концентрации 0,5 мас.%.

3. Протеолитический ферментный препарат, характеризующийся тем, что он получен способом по п.1 формулы изобретения.