Патент на изобретение №2156459

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОФЛОРЫ И ИММУННЫХ КОМПОНЕНТОВ ПРИСТЕНОЧНОГО МУЦИНА ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, к области бактериологии и иммунологии. Способ определения микрофлоры и иммунных компонентов пристеночного муцина толстого кишечника человека и мыши заключается в том, что биоптат (аутоптат) обрабатывают раствором мочевины с последующим посевом из серийных разведений на питательные среды и исследованием иммунных компонентов с помощью серологических реакций, в частности иммуноферментного анализа. Изобретение обеспечивает одновременное определение микрофлоры и иммунных компонентов пристеночного муцина. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, к области бактериологии и иммунологии.

Известен способ исследования показателей иммунитета, в частности иммуноглобулинов, в муцине толстого кишечника человека и мыши, заключающийся в индуцировании диареи фармакологическим препаратом и определении в полученной таким образом слизи содержания иммуноглобулинов при помощи серологических реакций. (Journal of Immunological Methods, 110 (1988) 85-91 Michael M.Gaspari, Peter T.Brenan, Scott M.Solomon and Charles O.Elson).

Известен способ исследования бактериального состава пристеночного муцина толстого кишечника мыши путем гомогенизации аутоптата, приготовления серийных разведений и посева на питательные среды, принятый нами за прототип (ЖМЭИ 1981, N 11, с.36-40 В.М. Коршунов, А.В. Бодрягина, Б.В. Пинегин). Недостатком прототипа является невозможность одновременного определения микрофлоры и иммунных компонентов пристеночного муцина толстого кишечника.

Задачами изобретения является возможность одновременного определения микрофлоры и иммунных компонентов пристеночного муцина толстого кишечника человека и мыши и упрощение этого исследования.

Решение поставленной задачи достигается предварительной обработкой раствором мочевины.

Молекула муцина – сложный биополимер гликопротеиновой природы, белковые субъединицы которого связаны между собой дисульфидными связями. Муцин не растворим в воде. Показано, что восстановление дисульфидных связей приводит к деполимеризации и растворению муцина. С этой целью предлагается использовать раствор мочевины концентрацией 1 моль/дм³. Мочевина не обладает бактерицидным действием, не лизирует лейкоциты, не тормозит реакцию связывания антитела с антигеном и эффективно деполимеризует муцин. При этом гуморальные иммунные компоненты муцина переходят в раствор, а бактерии и лейкоциты во взвесь. В дальнейшем бактериальный состав пристеночного муцина изучается бактериологическим методом, гуморальные иммунные компоненты – иммунологическими методами, лейкоциты концентрируются центрифугированием, в результате чего выделяется взвесь живых клеток, годных для исследований.

Способ осуществляется следующим образом. Забирают аутоптат интересующего участка толстой кишки мыши. Для этого забивают животное. Асептически вскрывают брюшную полость, выделяют интересующий участок толстой кишки. Необходимым условием является забор аутоптата из участка кишечника, не содержащего фекалий. Несоблюдение этого условия приводит к контаминации образца микроорганизмами фекалий и искажению результатов исследований. Интересующий участок перетягивают двумя лигатурами на расстоянии 10-12 мм друг от друга. Вырезают аутоптат длиной 8-10 мм, который представляет собой цилиндрический участок толстого кишечника. Затем разрезают аутоптат вдоль (для наиболее эффективного смывания муцина). Взвешивают аутоптат на торсионных весах. Оптимальная масса составляет 25-35 мг. Помещают аутоптат в стерильную пробирку и заливают заранее приготовленным отмывающим раствором. Соотношение объема отмывающего раствора в мкл и массы образца в мг составляет 100:1. Процесс растворения муцина осуществляют энергичным встряхиванием пробирки в течение 10 мин с помощью автоматического шейкера. Отбирают аликвоту 200 мкл для исследования иммунных компонентов, которую центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин, затем аккуратно отбирают супернатант 170 мкл для исследования гуморальных иммунных компонентов, а осадок суспензируют перемешиванием в оставшихся 30 мкл. Из полученной взвеси клеток готовят мазок или подсчитывают количество клеток в камере Горяева.

Биоптаты при эндоскопии, интраоперационный и секционный материал от человека забирают из участка кишечника, не соприкасавшегося непосредственно с фекалиями, взвешивают и помещают в раствор мочевины концентрацией 1 моль/дм³. Соотношение объема отмывающего раствора в мкл к массе образца в мг составляет 100:1. Обрабатывают аналогично вышеописанному.

При пересчете концентрации гуморальных иммунных компонентов на единицу массы навески необходимо умножить значение полученной концентрации на 100.

При пересчете количества лейкоцитов на 1 грамм массы навески используют следующую формулу:
количество клеток в 1 мкл10⁵/к, где к – объем общей аликвоты для исследования иммунных компонентов в мкл/объем взвеси клеток после отбора аликвоты для исследования гуморальных иммунных компонентов в мкл.

Из оставшейся после забора аликвоты для исследования иммунных компонентов взвеси микроорганизмов готовят серийные разведения до 10^-6, при этом в исходной пробирке разведение 10^-2, т.к. соотношение отмывающего раствора и навески составляет 100:1.

Рекомендуемая схема бактериологического исследования приведена в таблице.

Пример.

У беспородной белой мыши массой 20 г был забран аутоптат массой 32 мг. Аутоптат поместили в раствор для деструкции муцина объемом 3,2 мл и промывали в автоматическом шейкере 10 мин.

1. Расчет концентрации IgA, содержащегося в пристеночном муцине на единицу массы навески аутоптата.

После промывки в растворе для деструкции муцина была отобрана аликвота 200 мкл, которую центрифугировали в течение 10 мин при скорости 1000 об/мин. Затем отобрали супернатант 170 мкл. Концентрация IgA в супернатанте составила 0,0051 мг/мл. Концентрация IgA в образце составила 0,005110² =0,51 мг/г навески аутоптата.

2. Расчет количества лейкоцитов, содержащихся в пристеночном муцине, на единицу массы навески аутоптата.

После отбора 170 мкл осадок суспензировали в оставшихся 30 мкл. Полученной взвесью клеток заполнили камеру Горяева и подсчитали количество клеток в 1 мкл при увеличении 15х40. Количество клеток составило 79 в 1 мкл.

Расчет: 79/200/3010⁵=1,210⁶ клеток/г навески аутоптата.

3. Исследование бактериального состава пристеночного муцина.

Из оставшихся 3 мл взвеси бактерий в растворе для деструкции муцина приготовили серийные разведения до 10^-6, принимая разведение в исходной пробирке за 10^-2. Из серийных разведений были произведены высевы на питательные среды.

Результаты исследований
Микроорганизм – Результат
Род. Bifidobacterium – 10⁵ КОЕ/гр
Род. Lactobacillus – 10⁶ КОЕ/гр
Сем. Enterobacteriaceae – 1,210³ КОЕ/гр
Staphylococci – 3,410² КОЕ/гр
Streptococci – 1,210⁴ КОЕ/гр
Род. Clostridium – 310² КОЕ/гр
Yeasts – –
Таким образом, возможно одновременное определение микрофлоры и иммунных компонентов пристеночного муцина.

Формула изобретения

Способ определения показателей микробиоценоза и иммунитета в пристеночном муцине толстого кишечника, заключающийся в том, что для исследования берут навеску биоптата толстого кишечника, обрабатывают раствором мочевины, отбирают пробу для иммунологических исследований, центрифугируют ее, в супернатанте определяют иммуноглобулины, в осадке определяют лейкоциты, а из остатка первоначальной пробы готовят серийные разведения для бактериологического исследования.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 04.02.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 12-2003

Извещение опубликовано: 27.04.2003