Патент на изобретение №2284060

(54) СПОСОБ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и может быть использовано для лечения энцефалопатии различного генеза. Для этого подкожно вводят рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Способ обеспечивает лечебный эффект за счет увеличения количества эндогенных стволовых клеток организма и их хоминга в пораженные участки центральной нервной системы при исключении полипрагмазии. 5 табл.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и касается способа лечения энцефалопатии.

Известен способ лечения энцефалопатии с помощью комплексной терапии официнальными препаратами: антигипоксантами, транквилизаторами, блокаторами кальциевых каналов и ноотропами [1].

Данный способ является наиболее близким к заявляемому по достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.

Недостатком данного способа является одновременное назначение большого количества лекарственных средств с разнонаправленными механизмами действия, сопровождаемое высокой ксенобиотической нагрузкой на организм, приводящей, в свою очередь, к нарушению функционирования систем жизнеобеспечения. Вместе с тем известно, что полипрогмазия ведет к существенному усилению неблагоприятного побочного действия препаратов и снижению эффекта терапии [2]. Кроме того, несмотря на имеющийся для лечения энцефалопатии арсенал медикаментозных средств, зачастую не удается добиться не только «полного» излечения пациентов, но и достичь частичного восстановления ряда утерянных функций [1].

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности предлагаемого способа и снижение побочных эффектов терапии.

Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой способ лечения энцефалопатии, заключающийся в подкожном введении лабораторным животным (мыши) препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день в течение 5 дней.

Новым в предлагаемом изобретении является использование препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день в течение 5 дней для эффективной терапии энцефалопатии.

Данные отличительные признаки не обнаружены в научно-медицинской и патентной литературе, и предлагаемый способ соответствует критерию изобретения «Новизна».

Авторами в проанализированной литературе способа лечения энцефалопатии с помощью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора не найдено.

Практически все заболевания, травмы и отравления, в той или иной мере, сопровождаются нарушением энергетического обмена в организме и развитием гипоксии. При этом специфика функционирования клеточных элементов нервной ткани, заключающаяся в сочетании высокого уровня метаболической активности, сопряженной с интенсивным потреблением кислорода, и большой скоростью обновления фонда макроэргических веществ, делает центральную нервную систему наиболее уязвимой к воздействиям внешней и внутренней среды, сопровождающихся развитием гипоксии [3]. Угнетение аэробного окисления в тканях головного мозга существенно реорганизует центральную нервную систему, изменяет интегративно-пусковую деятельность нейронов и приводит к формированию качественно нового паттерна взаимодействия отдельных мозговых структур, а в случае декомпенсации механизмов адаптации запускает цепь патологических процессов, приводящих к прогрессирующим неврологическим нарушениям и расстройствам когнитивных функций – развитию энцефалопатии [1]. Кроме того, формирование новой патодинамической системы в мозговых структурах, ответственных за управление деятельностью внутренних органов и систем, зачастую способно приводить к развитию дизрегуляционной патологии висцеральных органов практически в любые сроки после воздействия [4].

Полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников организма открыли возможность развития новой стратегии лечения многих заболеваний – с помощью стволовых клеток [5]. При этом согласно имеющимся представлениям не вызывает сомнения факт возможности мобилизации собственных механизмов «глубокого» резерва – регионарных стволовых клеток, с помощью различных цитокинов, в том числе гранулоцитарного колониестимулирующего фактора [6]. Причем наиболее эффективным режимом введения данного препарата является его подкожное введение в дозе 125 мкг/кг в течение 5 дней [7].

Однако факт применения препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при энцефалопатии с достижением нового результата: создание эффективного способа лечения энцефалопатии, для специалиста является не очевидным.

Совокупность отличительных признаков не является очевидной для специалиста и не вытекает явным образом из уровня техники в данной области, что позволяет считать предлагаемое изобретение соответствующим критерию «Изобретательский уровень».

Способ осуществляют следующим образом:

Лабораторному животному (мыши) сразу после моделирования энцефалопатии в течение 5 дней 1 раз в день подкожно вводили 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рч Г-КСФ).

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 198 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Оценку состояния центральной нервной системы животных производили по регистрации показателей психоневрологического статуса: условно-рефлекторной деятельности и ориентировочно-исследовательскому поведению животных в открытом поле.

Через 1 сутки после моделирования энцефалопатии у животных вырабатывался условный рефлекс пассивного избегания [8], проверка сохранности рефлекса осуществлялась на 7, 14, 21-е сут эксперимента. Регистрация показателей ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле производилась на 3, 7, 14-е и 21-е сут после воздействия [8, 9].

О мобилизации стволовых клеток судили по изменению содержания нейральных клеток-предшественников в паравентрикулярной области головного мозга, количество которых определяли с помощью культуральных методов, основанных на способности нейральных стволовых клеток к нейросферообразованию в специальной культуральной среде [10].

Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стыодента и непараметрического U-критерия Вилкоксона – Манна-Уитни [11].

Пример 1.

Энцефалопатия моделировалось с помощью гермокамеры объемом 500 мл. Мыши помещались в гермокамеру, крышка закрывалась, и мыши оставались там до агонального судорожного припадка или остановки дыхания, определяемой визуально, в течение 10-15 секунд. После извлечения из гермокамеры и восстановления самостоятельного дыхания, через 5-10 минут, мыши вновь помещались в гермокамеру также до наступления агонального состояния (генерализованного судорожного припадка или остановки дыхания). Первой группе животных по схеме лечения способа прототипа вводили: диазепам 10 мг/кг/сутки, цитохром С 30 мг/кг/сутки, нифедипин 5 мг/кг/сутки и пирацетам по 400 мг/кг/сутки в течение 5 дней. Указанные дозы препаратов были определены в предварительных экспериментах как максимально эффективные при данной патологии. Опытным животным сразу после моделирования энцефалопатии подкожно 1 раз в день в течение 5 дней вводили 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора – нейпоген («Hofiman-la Roche», Швейцария) – растворенного в 0,2 мл растворителя.

В ходе эксперимента гипоксическое воздействие приводило к формированию энцефалопатии. Так, наблюдалось статистически значимое увеличение общей двигательной активности мышей (3-е сут) в открытом поле, числа горизонтальных перемещений (3, 7, 14-е сут) и повышение коэффициента асимметрии движений (3, 7, 14, 21-е сут), а также снижение количества актов груминга на 3-е сут опыта. В то же время отмечалось резкое падение уровня воспроизведения условного рефлекса пассивного избегания на 7, 14, 21-е сут эксперимента (до 45%, 45,5% и 46,1% от контрольных значений соответственно) и спонтанная смертность животных на протяжении всего периода наблюдения, достигающая на 21-е сут 27,3%.

Лечение животных по способу-прототипу нивелировало изменения показателей психоневрологического статуса в начальные сроки эксперимента (3, 7-е сут), но не влияло на нарушения двигательной активности и воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания в более позднем периоде (14, 21-е сут). В то же время отмечалось снижение процента гибели животных до 12,3% на 21-е сут. При этом изучение содержания нейральных клеток-предшественников в головном мозге мышей, получавших данные препараты на фоне моделирования энцефалопатии, статистически значимых изменений не выявило (табл.5).

Введение препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора после моделирования энцефалопатии приводило к полной нормализации показателей психоневрологического статуса животных на протяжении всего эксперимента: снижению общей двигательной активности, числа горизонтальных перемещений, коэффициента асимметрии движений в открытом поле, повышало уровень воспроизведения условного рефлекса пассивного избегания во все сроки наблюдения до величины соответствующих значений у интактных животных и отменяло спонтанную смертность в постгипоксическом периоде (табл.1, 4).

Изучение количества нейральных клеток-предшественников в паравентрикулярной области головного мозга при введении рч Г-КСФ выявило существенное увеличение их числа на 1-е и 7-е сут после воздействия (до 267,55 и 139,5% от фона соответственно) (см. табл.5).

Пример 2.

Энцефалопатия моделировалась на мышах линии CBA/CaLac, массой 18-20 г путем однократного внутрибрюшинного введения раствора солянокислого фенилгидразина в дозе 150 мг/кг. Первой группе животных по схеме лечения способа прототипа вводили: диазепам 10 мг/кг/сутки, цитохром С 30 мг/кг/сутки, нифедипин 5 мг/кг/сутки и пирацетам по 400 мг/кг/сутки в течение 5 дней. Указанные дозы препаратов были определены в предварительных экспериментах как максимально эффективные при данной патологии. Опытным животным сразу после моделирования энцефалопатии подкожно 1 раз в день в течение 5 дней вводили 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора – нейпоген («Hoffman-la Roche», Швейцария) – растворенного в 0,2 мл растворителя.

Проведенные исследования показали, что внутрибрюшинное введение гемолитического яда в дозе 150 мг/кг сопровождалось выраженными изменениями психоневрологического статуса экспериментальных животных. Так, изучение ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле показало рост коэффициента асимметрии движений на 3, 7, 14 и 21-е сут эксперимента, обусловленые увеличением количества горизонтальных перемещений мышей на 7, 21-е сут исследования, и падением числа обследований отверстий открытого поля на 14-е сут и уменьшением количества актов груминга на 3-е сут опыта. Кроме того, отмечалось снижение уровня воспроизведения условного рефлекса пассивного избегания на 7, 14, 21-е сут исследования (до 0% на 21-е сут) и спонтанная гибель животных после воздействия, достигающая 37,3% на 21-е сут эксперимента.

Назначение препаратов по способу-прототипу полностью отменяло появление признаков нарушения ориентировочно-исследовательского поведения животных в открытом поле, однако не оказывало существенного влияния на мнестическую функцию ЦНС. Вместе с тем лечение по способу прототипу не оказывало влияния на динамику содержания стволовых клеток в головном мозге животных. Кроме того, имела место смертность животных, составляющая к 21-м сут 21,6%.

Назначение препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора после введения соляно-кислого фенилгидразина сопровождалось нивелированием нарушений психоневрологического статуса мышей. У животных, леченых Г-КСФ, не наблюдалось изменений ориентировочно-исследовательского поведения на протяжении всего эксперимента относительно интактных животных. Кроме того, имела место отмена развития амнезии и снижение летальности до 10% на 21-е сут после воздействия (табл.2, 4).

Исследование содержания стволовых клеток в паравентрикулярной области головного мозга у животных при введении рч Г-КСФ выявило существенное возрастание их числа, причем на 1-е сут число стволовых клеток в мозговой ткани животных, леченых Г-КСФ, достигало 252,7% и 430,3% от величин аналогичных параметров у интактных животных и мышей с энцефалопатией соответственно (см. табл.5).

Пример 3.

Постгеморрагическую энцефалопатию моделировали у мышей линии CBA/CaLac, массой 18-20 г., путем пункции ретроорбитального синуса и выпускания через промытую раствором гепарина пастеровскую пипетку в течение 3-х часов дробно, за 3 раза, 70% объема циркулирующей крови. Расчет необходимого для забора количества крови производят из предположения, что у грызунов объем циркулирующей крови составляет 1/13 часть от массы тела животного. Первой группе животных по схеме лечения способа прототипа вводили: диазепам 10 мг/кг/сутки, цитохром С 30 мг/кг/сутки, нифедипин 5 мг/кг/сутки и пирацетам по 400 мг/кг/сутки в течение 5 дней. Указанные дозы препаратов были определены в предварительных экспериментах как максимально эффективные при данной патологии. Опытным животным сразу после моделирования энцефалопатии подкожно 1 раз в день в течение 5 дней вводили 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора – нейпоген («Hoffman-la Roche», Швейцария) – растворенного в 0,2 мл растворителя.

Потеря 70% объема циркулирующей крови приводила к достоверным изменениям двигательной активности животных в открытом поле и развитию выраженных нарушений мнестической функции центральной нервной системы экспериментальных животных. Имело место увеличение общей двигательной активности животных на протяжении всего эксперимента, рост коэффициента асимметрии движений на 3, 7, 14, 21-е сут исследований, за счет возрастания числа горизонтальных перемещений животных, и уменьшение количества актов груминга на 7, 14-е сут опыта. Кроме того, отмечались статистически значимое снижение уровня воспроизведения условного рефлекса пассивного избегания на 7,14, 21-е сут исследования (до 12% от контроля на 21-е сут) и спонтанная гибель животных до 20% на 21-е сут эксперимента.

Изучение психоневрологического статуса мышей при лечении их по способу прототипу показало выраженное повышение уровня воспроизведения условного рефлекса пассивного избегания, отмену гибели животных в постгеморрагическом периоде и улучшение двигательной активности животных в открытом поле. В то же время в отдаленные сроки нарушения ориентировочно-исследовательского поведения мышей, леченных по схеме способа прототипа, сохранялись (увеличение коэффициента асимметрии движений). При этом исследование содержания нейральных стволовых клеток в головном мозге животных, леченых по способу прототипу, достоверных изменений не выявило.

Введение рч Г-КСФ приводило к нормализации ориентировочно-иследовательского поведения животных, отмене возникновения нарушений мнестических функций ЦНС, а также отмене гибели животных в постгеморрагическом периоде (табл.3, 4).

Выяснение возможного механизма действия Г-КСФ показало существенное увеличение количества стволовых клеток в головном мозге на 1-е и 7-е сут эксперимента в группе мышей, леченных рч Г-КСФ, по отношению как к интактному контролю, так к группе животных с энцефалопатией (см. табл.5).

Таким образом, препарат рч Г-КСФ обладал выраженным лечебным действием в отношении энцефалопатии различного генеза, причем по ряду показателей его терапевтический эффект превосходил эффект комплексного медикаментозного лечения по способу-прототипу. При этом механизмом действия рч Г-КСФ являлась мобилизация эндогенных стволовых клеток организма и их хоминг в пораженные участки центральной нервной системы.

Предлагаемый способ соответствует критерию «Промышленно применимо»

Предлагаемый способ позволяет лечить энцефалопатию с помощью введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.

Источники информации

1. Алексеева Г.В., Гурвич А.М., Семченко В.В. Постреанимационная энцефалопатия (патогенез, клиника, профилактика и лечение). – Омск; Омская областная типография, 2003. – 152 с.

2. Зборовский А.Б., Тюренков И.Н. Осложнения фармакотерапии. – М.: Медицина, 2003. – 543 с.

3. Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. / Сб. Под ред. Ю.Л.Шевченко. – Санкт-Петербург, ООО «ЭЛБИ-Сб», 2000. – 384 с.

4. Дизрегуляционная патология. / Под ред. Г.Н.Крыжановского. – М.: Медицина, 2002. – 652 с.

5. Holtzer H. Cell lineages, stem cells and the quantal cell cycle concept / Stem cells and tissue homeostasis. Eds: B.I.Lord, C.S.Poten, R.J.Cole. – New York, Cambrige Unyversity Press, 1978. – P.1-28.

8. Буреш Я, Бурешова О., Хьюстон Дж. П.Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. / пер. с англ. Под ред проф. A.C.Батуева). – М.: Высшая школа, 1991. – 398 с.

11. Лакин Г.Ф. Биометрия. – М.: Высшая школа, 1973. – 215 с.

Формула изобретения

Способ терапии энцефалопатии, заключающийся во введении препарата, отличающийся тем, что в качестве препарата используют рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, который вводят подкожно.