Патент на изобретение №2281503

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ТЕЧЕНИЯ ХЛАМИДИЙНОГО КОНЪЮНКТИВИТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии Определяют суммарный уровень конечных метаболитов оксида азота (NO₂ ^–/NO₃ ^–) в сыворотке крови больных хламидийным конъюнктивитом. При концентрации NO₂ ^–/NO₃ ^– выше 50 мкмоль/л диагностируют острую форму хламидийного конъюнктивита. Способ обеспечивает хорошую воспроизводимость.

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может быть использовано с целью дифференциальной диагностики острой и хронической формы течения хламидийного конъюнктивита.

Хламидийные конъюнктивиты (ХК) составляют значительную долю всех конъюнктивитов, и, как правило, характеризуются длительным рецидивирующим течением и устойчивостью к проводимой терапии. Учитывая, что распространенность хламидийных поражений глаз в последнее время имеет тенденцию к росту, проблема поиска эффективного метода диагностики с целью уточнения стадии заболевания имеет большое значение в отношении выбора тактики лечения.

Известен способ диагностики хронического урогенитального хламидиоза, включающий изучение реакции лейкоцитов макроорганизма на присутствие инфекционного агента путем исследования спонтанной и стимулированной зимозаном хемилюминесценции лейкоцитов, где в качестве индуктора используют лизат элементарных телец хламидий. При индексе хемилюминесценции по зимозану (ИХЛ-з) 21,35ИХЛ-з31,41 и специфическому антигену (ИХЛ-аг) 0,53ИХЛ-аг1,00 диагностируют хроническую хламидийную инфекцию, а при ИХЛ-з<21,35 и ИХЛ-аг>1,00 диагностируют острую стадию заболевания (Прохоренков В.И., Шапран М.В., Тюкавкин В.В. Патент РФ №2000109432, 2002). Недостатком способа является трудоемкость методики и использование дорогостоящего оборудования (хемилюминометр).

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ определения клинической формы хламидийного заболевания, основанный на серологическом методе исследования крови (IgG, IgA, IgM) посредством иммуноферментного анализа (ИФА). При титре IgG>100-6400, IgA>50-1600 и IgM>50-3200 выставляют острую стадию заболевания, а при титре IgG>50-200, a IgA>100-1600 – хроническую (Мальханов В.Б., Гумерова Е.И., Шевчук Н.Е., Значение диагностических лабораторных исследований при офтальмоинфекциях и паразитарных заболеваниях глаз, Уфа, 2001). Однако, как отмечают сами авторы, чувствительность метода колеблется от 65 до 70%.

Технический результат – назначение патогенетически обоснованной терапии, оптимизирующий прием антибактериальных средств по дозе, длительности и виду, с целью предупреждения перехода ХК в антибиотикорезистентную форму непрерывно рецидивирующего характера и развития осложнений со стороны глазного яблока.

Технический результат достигается способом дифференциальной диагностики острой и хронической формы течения хламидийного конъюнктивита путем исследования сыворотки крови пациентов, отличающийся тем, что определяют суммарный уровень конечных метаболитов оксида азота (NO₂ ^–/NO₃ ^–) и при концентрации NO₂ ^–/NO₃ ^– в сыворотке крови выше 50 мкмоль/л течение заболевания оценивают как острое, а при концентрации NO₂ ^–/NO₃ ^– в сыворотке крови ниже 50 мкмоль/л – как хроническое.

Содержание NO₂ ^–/NO₃ ^– в сыворотке крови определяют по модифицированной методике Schmidt H.H.H.W., Kelm M. (Methods in Nitric Oxide Research. Ed. by M.Feelisch and J.S.Stamler. 1996, John Wiley and Sons Ltd. P.491-497).

Способ осуществляют следующим образом.

Для определения общего содержания NO₂ ^–/NO₃ ^– в крови получают сыворотку путем центрифугирования образца в пробирке при 200g (1500 об/мин, центрифуга ОПН-3) в течение 10 мин. Отбирают 1 мл сыворотки в другую пробирку и депротеинизируют путем двухэтапного осаждения белков центрифугированием при ˜6000g (8000 об/мин, центрифуга ОПН-8) при добавлении к ней на первом этапе 1,8 мл 96% спирта, а на втором – 0,2 мл 15% сульфата цинка. После этого 1 мл супернатата переносят в следующую пробирку, добавляют 2 мл дистиллированной воды, 1 мл глицинового буфера (рН=9,7), всыпают 8 г кадмиевых гранул, активированных в 5 mM сульфате меди в течение 5 мин, и инкубируют при t=20-22°C в течение 60 мин. Затем переносят 3 мл смеси в другую пробирку и добавляют 0,6 мл 17,5 mM сульфаниламида в 6 М соляной кислоте и инкубируют при t=0-4°C (на ледяной подушке) 25 мин. После этого добавляют 0,2 мл 20,0 mM N-(1-нафтил)-этилендиамина и инкубируют при t=22°C в течение 20 мин. На завершающем этапе определяют оптическую плотность на спектрофотометре (фотоэлектроколориметре) в кюветах с длиной оптического пути 1 см при длине волны 540 нм против кюветы, содержащей 3,6 мл дистиллированной воды и 0,2 мл 20,0 mM N-(1-нафтил)-этилендиамина. Расчет концентрации проводят по калибровочному графику для нитрата калия и умножают на коэффициент разведения (k=3). Полученную концентрацию NO₂ ^–/NO₃ ^– выражают в мкмоль/л.

Нормальные значения NO₂ ^–/NO₃ ^– сыворотки крови, установленные у 10 клинически здоровых доноров в возрасте от 24 до 56 лет вышеописанным методом, составляют 41,5±5,9 мкмоль/л.

Проведенные клинико-лабораторные исследования позволили установить диапазоны концентрации NO₂ ^–/NO₃ ^– в сыворотке, соответствующие острой и хронической формам ХК.

Так, концентрация NO₂ ^–/NO₃ ^– сыворотки крови, превышающая 50 мкмоль/л, соответствует острой форме течения ХК (длительность заболевания менее 1 мес.). При концентрации NO₂ ^–/NO₃ ^– меньше 50 мкмоль/л выставляют хроническую форму ХК (длительность заболевания больше 1 мес.).

Приводим подробные клинические примеры для каждой формы течения ХК.

Пример 1. Больной К., 28 лет (и.б. №30-0533 за 2004 г.) поступил на стационарное лечение в УфНИИГБ на 5 сутки с начала клинических проявлений ХК с жалобами на слезотечение и покраснение левого глаза. При объективном осмотре: OD – Конъюнктива бледно-розовая, оптические среды прозрачные. С глазного дна розовый рефлекс. Острота зрения 1,0; OS – глазная щель несколько сужена, веки слегка отечны, из конъюнктивальной полости слизисто-гнойное отделяемое в умеренном количестве, конъюнктива век гиперемирована, на нижнем своде множественные сосочки, небольшой отек роговицы в поверхностных слоях, глубжележащие отделы глаза без патологических изменений. Острота зрения 1,0. Методом флуоресцирующих антител определялось свечение антигена C.trachomatis в соскобе с конъюнктивы OS в значительном количестве клеток. ПЦР анализ подтвердил наличие C.trachomatis в соскобе с конъюнктивы OS. Содержание NO₂ ^–/NO₃ ^– сыворотки крови на 7 день заболевания составило 50,89 мкмоль/л. Выставлен клинический диагноз: OS: Острый ХК, папиллярная форма, эпителиальный кератит. В данном случае острая форма клинического течения ХК установлена на основании значения NO₂ ^–/NO₃ ^– больше 50 мкмоль/л. Последующий характер клинического течения – выздоровление на 21 день, отсутствие рецидивов, а также данные ИФА сыворотки крови на антитела к C.trachomatis это подтвердили. Титр антител, выявляемый иммуноферментным анализом, соответствовал для IgG 50, IgA 200; IgM 800.

Пример 2. Больной С., 29 лет (амб. карта №0173-04, 2004 г.) поступил на амбулаторное лечение в УфНИИГБ на 7 сутки с начала клинических проявлений ХК с жалобами на слезотечение, чувство инородного тела и покраснение правого глаза. При объективном осмотре: OD – глазная щель умеренно сужена, веки отечные, из конъюнктивальной полости слизисто-гнойное отделяемое в значительном количестве, конъюнктива век гиперемирована (больше нижнее), на нижнем своде множественные сосочки, небольшой отек роговицы в поверхностных слоях, глубжележащие отделы глаза без патологических изменений. Острота зрения 0,8 (не корригирует). OS – Конъюнктива бледно-розовая, оптические среды прозрачные. С глазного дна розовый рефлекс. Острота зрения 1,0. Методом флуоресцирующих антител определялось свечение антигена C.trachomatis в соскобе с конъюнктивы OS в значительном количестве клеток. ПЦР анализ подтвердил наличие C.trachomatis в соскобе с конъюнктивы OS. Содержание NO₂ ^–/NO₃ ^– сыворотки крови на 8 день заболевания составило 85,10 мкмоль/л. Титр антител, выявляемый иммуноферментным анализом, соответствовал для IgG 25, IgA 50; IgM 50. Выставлен клинический диагноз: OD: Острый ХК, папиллярная форма, эпителиальный кератит. Острая форма течения ХК установлена на основании значения NO₂ ^–/NO₃ ^– более 50 мкмоль/л. Данные иммуноферментного анализа сыворотки крови, установившиеся концентрации иммуноглобулинов трех классов А, М и G к C.trachomatis, не позволили дифференцировать у больного острую или хроническую форму ХК.

Пример 3. Больная С., 47 лет (и.б. №30-6392 за 2003 г.) поступила на стационарное лечение в УфНИИГБ с жалобами на периодически возникающее чувство жжения в обоих глазах в последние 5 лет. При объективном осмотре: OU – Конъюнктива век умеренно гиперемирована, слегка отечна, инфильтрирована, переходные складки век валикообразно утолщены, в конъюнктивальной полости слизисто-гнойное отделяемое в небольшом количестве, оптические среды прозрачные. С глазного дна розовый рефлекс. Острота зрения OU: 0,7 с корр. +1,5Д=1,0. Методом флуоресцирующих антител определялось свечение антигена C.trachomatis в соскобе с конъюнктивы OS в небольшом количестве клеток, OD – не определялось. ПЦР анализ подтвердил наличие C.trachomatis в соскобе с конъюнктивы OU. Содержание NO₂ ^–/NO₃ ^– сыворотки крови на 2 день стационарного обследования составило 37,77 мкмоль/л. Выставлен клинический диагноз: OU: Хронический ХК, инфильтративная форма. В данном случае хроническое течение заболевания установлено на основе небольших значений (менее 50 мкмоль/л) содержания NO₂ ^–/NO₃ ^–, что совпало с рецидивирующим характером течения заболевания и данными ИФА титра специфических антител против хламидий (IgG 100, IgA 200).

Заявленным способом обследовано 19 больных ХК, у которых острое или хроническое течение ХК установлено на основании концентрации NO₂ ^–/NO₃ ^– в сыворотке крови. При этом у 5 больных ХК носил острое, а у 14 – хроническое течение. У 15 больных ХК заявленная концентрация NO₂ ^–/NO₃ ^– в сыворотке крови совпадала с клиническим течением (4 – с острым ХК, 11 – с хроническим ХК), что составило 79%. У 4 больных концентрация NO₂ ^–/NO₃ ^– в сыворотке крови не соответствовала клиническому течению ХК (1 – с острым ХК, 3 – с хроническим ХК), что составило 21%. Следовательно, клиническая форма течения ХК на основании показателей содержания NO₂ ^–/NO₃ ^– в сыворотке крови, может быть определена с точностью 79%.

Таким образом, использование данного способа диагностики клинической формы течения ХК дает возможность обоснованно назначить патогенетически ориентированную терапию. Предложенный способ отличается более высокой информативностью результатов (79%), чем ИФА (65-70%), а с учетом его относительной простоты и хорошей воспроизводимости может быть применен в лечебных учреждениях, имеющих биохимическую лабораторию, поэтому способ является доступным, а следовательно, “практически применимым”.

Формула изобретения

Способ диагностики острого течения хламидийного конъюнктивита путем исследования сыворотки крови пациентов, отличающийся тем, что определяют суммарный уровень конечных метаболитов оксида азота (NO₂ ^–/NO₃ ^–) и при концентрации его в сыворотке крови выше 50 мкмоль/л течение заболевания оценивают как острое.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.12.2006

Извещение опубликовано: 27.08.2008 БИ: 24/2008