Патент на изобретение №2280688

(54) РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia COLI ZV1 – НОСИТЕЛЬ КЛОНИРОВАННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ХРОМОСОМНОЙ ДНК Burkholderia pseudomallei, ДЕТЕРМИНИРУЮЩЕЙ СИНТЕЗ БЕЛКА 32 kDa И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ПЕФЛОКСАЦИНУ И СТРЕПТОМИЦИНУ

(57) Реферат:

Изобретение относится к микробиологии и молекулярной биологии и касается конструирования рекомбинантных штаммов Е. coli, несущих клонированные последовательности генома возбудителя мелиоидоза В. pseudomallei, детерминирующие различные спектры лекарственной устойчивости. KpnI-фрагментами хромосомной ДНК штамма В. pseudomallei 56770 SMR2, лигированными с KpnI-рестриктами вектора pUC19, трансформируют компетентные клетки Е. coli JM107, отбирают клоны, имеющие сочетанную резистентность к антимикробным препаратам различных классов, проводят плазмидный скрининг рекомбинантных клонов и гибридизационный анализ для детекции клонированного фрагмента хромосомной ДНК, используя в качестве зонда последовательности хромосомы В. pseudomallei. Определяют наличие продукта экспрессии клонированной последовательности хромосомной ДНК методом иммуноблоттинга с иммуноглобулинами специфической мелиоидозной антисыворотки. Полученный рекомбинантный штамм ZV1 депонирован в государственной коллекции патогенных бактерий “Микроб” под номером КМ 167 и обладает резистентностью к пефлоксацину и стрептомицину. Использование изобретения позволит изучить молекулярно-генетические основы множественной лекарственной В. pseudomallei и исследовать функциональную роль отдельных протеинов в формировании полирезистентности у возбудителя мелиоидоза. 1 ил., 1 табл.

Изобретение относится к микробиологии и молекулярной биологии и касается конструирования рекомбинантных штаммов Е.coli, несущих клонированные последовательности генома возбудителя мелиоидоза В. pseudomallei, детерминирующие различные спектры лекарственной устойчивости. Полученный штамм Е.coli ZV1 является продуцентом рекомбинантной плазмидной ДНК pJla1 с клонированным фрагментом хромосомной ДНК В.pseudomallei, детерминирующим синтез белка 32 kDa и резистентность к пефлоксацину (Pf^R) и стрептомицину (Sm^R). Штамм предназначен для изучения молекулярно-генетических основ множественной лекарственной устойчивости В. pseudomallei. Штамм депонирован в Государственной Коллекции Патогенных Бактерий “Микроб” (ГКПБ “М”) под номером KM167.

Следует отметить, что исследования, направленные на расшифровку механизмов формирования резистентности В.pseudomallei, могут послужить основой для понимания основных биохимических особенностей микроорганизма, предопределяющих его повышенную метаболическую пластичность, приспособляемость к воздействию специфических и неспецифических ингибиторов и защитных факторов макроорганизма, а также дать необходимый материал в разработке новых подходов к применению антибиотиков при лечении мелиоидозной инфекции. Возможности изучения механизмов лекарственной резистентности определяются наличием молекулярно-биологических методов и модельных систем, позволяющих идентифицировать и осуществлять анализ последовательностей генома, детерминирующих резистентность. Необходимыми элементами здесь являются специальные штаммы, несущие генетические детерминанты измененной чувствительности, методы молекулярного анализа R-детерминант различных типов, а также клонирование последовательностей детерминант резистентности и анализ их экспрессии в гетерологичных системах.

На сегодняшний день имеется ряд сообщений о клонировании и анализе экспрессии генов В.pseudomallei, детерминирующих резистентность к антимикробным соединениям различных классов. Так, в Е.coli клонирован хромосомный ген blaA_BPS В.pseudomallei, кодирующий -лактамазу, способную гидролизовать пенициллины и отдельные цефалоспорины [Cheung Т., Но Р., Woo P., et al. Cloning and expression of class A -lactamase gene blaA_{BPS BPS} В. pseudomallei и клонирована в Е. coli в составе вектора pBK-CMV. Рекомбинантные плазмиды pBKCMV01 и pBKCMV07 стабильно реплицировались в штаммах кишечной палочки. Аминокислотная последовательность рекомбинантной -лактамазы с изоэлектрической точкой pI 7.7 и молекулярной массой 29.1 kDa имела высокую степень гомологии с -лактамазами класса А, такими как PenA В.cepacia, BlaI Yersinia enterocolitica, CTX-M-18 Klebsiella pneumoniae, SFO-1 Entero-bacter cloacae, FONTA-4 Serratia fonticola и OXY Klebsiella oxytoca.

Во многом аналогичный подход был использован при клонировании и анализе экспрессии -лактамазы D-класса В.pseudomallei [Niumsup P., Wuthiekanun V. Cloning of the class D -лактамазам класса D, имели высокий уровень устойчивости к цефтазидиму и оксациллину. Анализ клонированных последовательностей позволил идентифицировать ген, обозначенный оха-42 и кодирующий -лактамазу расширенного спектра, гомологичную некоторым оксациллин-гидролизующим энзимам, таким как ОХА-22 Ralstonia pickettii, AsbB, AmpS и AmpH различных видов Aeromonas, OXA-18 Pseudomonas aeruginosa и ОХА-9 Klebsiella pneumoniae.

Целью изобретения является конструирование штамма Е.coli, несущего стабильно реплицирующуюся рекомбинантную плазмиду с клонированной последовательностью хромосомной ДНК В. pseudomallei, детерминирующей резистентность к антимикробным соединениям различных классов.

В качестве источника хромосомной ДНК был использован штамм В.pseudomallei 56770 SMR2, имеющий высокий уровень резистентности к цефалоспоринам, фторхинолонам, аминогликозидам, -лактамам и отличающийся стабильным сохранением фенотипа резистентности при длительном культивировании в неселективных условиях. Хромосомную ДНК выделяли методом нейтрального лизиса [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. – Пер. с англ., М.: Мир, 1984. – 392 с.] из 24-часовой культуры возбудителя мелиоидоза, выращенной на Nutrient-arape (Difco) с пефлоксацином (60 мкг/мл) при 37°С.

Хромосомную ДНК В. pseudomallei 56770 SMR2 и вектор pUC19 подвергали полному гидролизу эндонуклеазой KpnI и после переосаждения лигировали в соотношении 25:1. В нескольких сериях опытов трансформировали лигазной смесью компетентные клетки Е. coli JM107, полученные стандартным кальциевым методом [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. – Пер. с англ., М.: Мир, 1984. – 392 с.], с последующим высевом на плотную питательную среду Antibiotic medium 2 (Difco), содержащую Pfx 0.4 мкг/мл.

Трансформанты, резистентные к пефлоксацину, дополнительно исследовали на устойчивость к аминогликозидам (канамицин, стрептомицин, гентамицин), -лактамам (ампициллин) и карбапенемам (имипенем).

Для детекции клонированного фрагмента хромосомной ДНК В.pseudomallei был использован гибридизационный анализ. Зонд (последовательности хромосомы В.pseudomallei 56770 SMR2) метили био-11-dUTP в ПЦР с использованием прямого и обратного праймеров pUC/M13 при следующих параметрах реакции: денатурация 95°С – 30 с, отжиг 50°С – 40 с, элонгация 72°С – 50 с. Для визуализации результатов гибридизации использовали набор “Нерадиоактивное определение ДНК” (НПО “Силекс”, Россия).

Рекомбинантный штамм Е.coli ZV1 (pJla1), полученный путем трансформации клеток Е.coli JM107 KpnI-фрагментами хромосомной ДНК В. pseudomallei 56770 SMR2, лигированными с вектором pUC19, обладает резистентностью к пефлоксацину (Pf^R) и стрептомицину (Sm^R), утрачивает маркер резистентности вектора (Ар^S), сохраняет основные культурально-морфологические и биохимические свойства Е.coli JM107. Штамм Е.coli ZV1 (pJla1) является носителем высококопийного плазмидного репликона pJlal размером 6.1 т.п.н. Уровень выхода (синтеза) плазмидной ДНК pJlal в штамме составляет 0.25 мг/л при плотности культуры OD/600=0.5. По данным рестрикционного и гибридизационного анализа, плазмида pJlal несет в своем составе ori репликации вектора pUC19, а также фрагмент клонированной хромосомной ДНК В.pseudomallei размером приблизительно 5.5 т.п.н. Продуктом экспрессии клонированного фрагмента является протеин с молекулярной массой 32 kDa, специфически взаимодействующий с иммуноглобулинами мелиоидозной антисыворотки в вестерн-блоттинге.

Пример 1. Испытание рекомбинантного штамма Е.coli ZV1 (pJla1) no проявлению антибиотикорезистентности в сравнении с реципиентным штаммом Е.coli JM107.

Устойчивость штаммов к антибиотикам определяют методом серийных разведений на плотных питательных средах, оценивая МПК препарата для 5×10⁴ м.к. Бактериальные суспензии готовят из 24 ч агаровых культур, выращенных при 37°С. Результаты сравнительного анализа уровней резистентности рекомбинантного штамма Е.coli ZV1 (pJla1) и исходного штамма Е.coli JM107 к антибактериальным препаратам различных классов приведены в таблице.

Как следует из полученных данных, рекомбинантный штамм Е.coli ZV1 (pJla1) обладает резистентностью к отдельным антибиотикам аминогликозидного (стрептомицин) и фторхинолонового (пефлоксацин) рядов.

Пример 2. Анализ продуктов экспрессии клонированной последовательности хромосомной ДНК В.pseudomallei.

Бактериальные клетки, выращенные в течение 24-48 ч при 37°С на питательном агаре, ресуспендируют в лизирующем буфере (0.0625 М Трис-HCl рН 6.8, 2% SDS, 10% глицерин, 5% -меркаптоэтанол), прогревают 5 мин при 100°С и удаляют нелизированный материал центрифугированием при 5000 g. 10-15 мкл супернатанта анализируют электрофорезом в полиакриамидном геле. Для электрофореза используют гели (11% полиакриламид, 0.1% SDS), приготовленные по методу Laemmli [Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. – Nature. – 1970. – V.227. – P.680-685]. Электрофорез проводят при стабилизированом токе 5 mA в течение 18 ч в вертикальном аппарате SE400 (HSI). Для контроля скорости фракционирования в образцы вносят 0.004% бромфенолового синего. Для окрашивания гелей используют Кумасси G-250 (Serva).

Электрофоретический перенос белков на нитроцеллюлозные мембраны ВА83 (LKB) с размером пор 0.22 ₂) и обрабатывают раствором субстрата (0.02% бром-хлор-индолил-фосфат, 0.02% нитросиний тетразолий в буфере АР).

В иммуноблоттинге (чертеж) выявляется специфическое взаимодействие мелиоидозных иммуноглобулинов с препаратом общеклеточных белков Е. coli Е. coli ZV1 (белок 32 kDa) и препаратами, использованными в качестве положительных контролей (общеклеточные белки В.pseudomallei 56770, В. thailandensis E264). Препарат общеклеточных белков штамма Е. coli JM107 не содержит компонентов, специфически взаимодействующих с иммуноглобулинами мелиоидозной антисыворотки.

Формула изобретения

Штамм Escherichia coli ZV1 KM167 (Государственная коллекция патогенных бактерий “Микроб”) – носитель рекомбинантной плазмидной ДНК рJ1а 1 с клонированным фрагментом хромосомной ДНК Burkholderia pseudomallei, детерминирующим синтез белка 32 kDa и резистентность к пефлоксацину (Rf^R) и стрептомицину (Sm^R).

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 23.12.2006

Извещение опубликовано: 20.06.2008 БИ: 17/2008