Патент на изобретение №2278870

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ, ВЫДЕЛЕНИЯ, ОЧИСТКИ И СТАБИЛИЗАЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА, ПРИГОДНОГО ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ, И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины и касается способа получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (рчГ-КСФ), пригодного для медицинского использования, путем разрушения рекомбинантных бактериальных клеток, выделения тел включения, удаления примесных бактериальных белков, восстановления, ренатурации, хроматографической очистки и стабилизации рчГ-КСФ, а также иммунобиологического средства на его основе. Изобретение обеспечивает высокий выход, качество и стабильность рчГ-КСФ. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 табл.

Изобретение относится к фармацевтике, а именно к способу получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного человеческого гранулоцитного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ), пригодного для медицинского применения.

Гранулоцит-колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) является плейотропным цитокином, стимулирующим пролиферацию, созревание и функцию гранулоцитсодержащих лейкоцитов крови [1, 2, 3]. Г-КСФ является полипептидом с молекулярной массой 18-22 кДа и продуцируется различными типами клеток, включая Т-и В-лимфоциты, макрофаги, тучные клетки, эндотелиальные клетки и фибробласты [4, 5].

Г-КСФ используется для активации кроветворения при многих гематологических нарушениях, для увеличения продукции лейкоцитов и уменьшения частоты инфекционных осложнений при различных нейтропениях, апластической анемии, миелодисплазии, трансплантации костного мозга [6-9]. Отмечена эффективность Г-КСФ при лечении больных с прогрессирующими злокачественными опухолями, получающих химиотерапию [10]. Выявлено, что рчГ-КСФ снижает продолжительность нейтропении при химиотерапии злокачественных опухолей и трансплантации костного мозга [11-12]. Г-КСФ стимулирует пролиферацию и дифференцировку нейтрофильных гранулоцитов и мононуклеарных фагоцитов из общих клеток-предшественников [2, 3, 13], увеличивает выживание нейтрофилов, усиливает фагоцитоз, хемотаксис, продукцию IL-8 нейтрофилами, активирует фагоцитарную и бактерицидную активности нейтрофилов [14-17]. Показано, что Г-КСФ, укорачивает период гранулоцитопении, индуцируемой облучением [18].

Эффективность Г-КСФ в терапии ряда заболеваний иммунной и кроветворной систем делают актуальной задачей разработку методов его получения.

Известны способы получения Г-КСФ человека из культуральной жидкости клеточных линий, полученных из опухолевых клеток человека [19-21]. Недостатками этих способов являются использование опухолевых клеток, низкий выход продукта, вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, невозможность масштабирования процесса выделения и, как следствие, высокая стоимость такого препарата Г-КСФ.

Растущие потребности в Г-КСФ и отсутствие высокопродуктивных природных источников способствовали получению Г-КСФ микробиологическим синтезом на основе технологии рекомбинантных молекул ДНК. Этот метод обеспечивает возможность масштабирования и получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. В процессе роста бактериальных клеток рчГ-КСФ накапливается в цитоплазме в виде нерастворимых дискретных включений, получивших название тел включения. Методология выделения рч Г-КСФ из тел включения заключается в экстракции белка из тел включения денатурирующими агентами (при этом белок денатурируется и теряет биологическую активность), ренатурации целевого продукта и хроматографии ренатурированного белка. Поскольку выход и качество целевого продукта в значительной степени зависят от эффективности проведения ренатурации, возникает необходимость введения контроля за ренатурацией.

Описан способ получения рекомбинантного человеческого Г-КСФ (рчГ-КСФ) из клеток Escherichia coli (E. coli), трансформированных плазмидой p536hG-CSF2 [22, 23]. Клетки суспендируют в воде и суспензию несколько раз продавливают в Френч-прессе. Осадок тел включения после центрифугирования растворяют в 50 мМ трис-HCI буфере, рН 8,5, содержащем 1% лауриловую кислоту и 5% этанол. Нерастворимый материал отделяют центрифугированием, а супернатант, содержащий рчГ-КСФ, подвергают очистке методом ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой (С₄). Связаный с сорбентом рчГ-КСФ элюируют ацетат-аммонийным буфером, содержащим изопропанол. Чистота препарата по результатам гель-электрофореза в полиакриламидном геле более 95%. Недостатком этого метода является отсутствие этапа отмывки тел включения, использование органических растворителей, в которых белок может частично денатурировать, и низкий выход целевого белка.

Описан и другой способ выделения рчГ-КСФ из клеток E. coli, трансформированных плазмидой p536hG-CSF2, в буферах, не содержащих органических растворителей [23]. Этот метод включает разрушение клеток при помощи Френч-пресса, отмывку тел включения 50 мМ Трис-HCI буфером, содержащим 2% саркозила, растворение тел включения в 6 М гуанидинхлориде, ренатурацию при помощи гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25, ионообменную и гель-фильтрационную хроматографию ренатурированного белка на колонках с КМ-целлюлозой и сефадексом G-75 соответственно. Чистота рчГ-КСФ составляла более 95%. Выход составлял 0,4 мг очищенного белка на грамм сырой биомассы. Недостатками этого способа являются низкий выход целевого белка и отсутствие контроля над процессом ренатурации.

Известен способ получения рекомбинантного Г-КСФ человека из клеток Е. coli, содержащих плазмиду pCfBD28 [24]. Клетки разрушают ультразвуком в трис-HCl буфере. Тела включения отделяют центрифугированием и промывают. Отмытые тела включения растворяют в 20 мМ трис-HCl буфере, рН 8,5, содержащем 8 М мочевину и 0,1 мМ дитиотриэтол, и инкубируют в течение 5 ч при температуре 4°С. Ренатурацию восстановленного белка проводят в присутствии 0,1 мМ окисленного глутатиона в течение ночи при температуре 4°С. Ренатурированный белок подвергают ионообменной и гидрофобной хроматографии на колонках ДЭАЭ-Тойоперл и Бутил-Тойоперл соответственно. Очищенный рчГ-КСФ обессоливают на колонке с сефадексом G-25 в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,2. Электрофоретическая чистота получаемого рчГ-КСФ составила более 99%. Выход очищенного рчГ-КСФ составил 33% по отношению к количеству рчГ-КСФ в телах включения. Недостатками этого способа являются использование для ренатурации дорогостоящего окисленного глютатиона, отсутствие контроля за ренатурацией, в результате происходит потеря части целевого белка при хроматографии.

Прототипом заявляемого способа получения Г-КСФ является способ получения рчГ-КСФ из клеток Е. coli SG20050, трансформированных плазмидой pGGF8 [25]. Клетки разрушали при помощи ультразвука, тела включения отмывали и растворяли при помощи 8М мочевины, ренатурацию рчГ-КСФ проводили разбавлением нейтральным буфером. Хроматографическую очистку рчГ-КСФ осуществляли при помощи одноэталной ионообменной хроматографии на двух последовательно соединенных колонках с ДЭАЭ-целлюлозой и SP-сефадексом при рН 4,4 с последующим элюированием целевого белка с колонки с SP-сефадексом в линейном градиенте хлористого натрия (от 0 до 0,4 М) в 0,02 М натрий ацетатном буфере при рН 4,4-4,5. Выход целевого продукта составил 24-30 мг из 1 л культуры клеток Е. coli SG 20050/pGGF8. Очищенный препарат содержал 200 нг бактериальных белков и 80 пкг ДНК на мг рчГ-КСФ.

Недостатками способа-прототипа являются следующие:

1. Используемая схема отмывки тел включения приводит к потере целевого продукта. В отмытых телах включения, полученных из 10 г биомассы, рчГ-КСФ составляет 151 мг.

2. Отсутствие контроля за ренатурацией приводит к потери части рчГ-КСФ на этапе хроматографии. (Выход очищенного белка составил 24-30 мг на 1 л культуры).

3. Получаемые по заявленному способу препараты рчГ-КСФ содержат значительное количество примесей белков и ДНК штамма-продуцента (около 200 нг и 80 пкг на мг рчГ-КСФ соответственно).

4. Получаемый по заявленному способу препарат рчГ-КСФ содержит 0,1 М NaCI, что приводит к нестабильности белка при хранении при температуре 4±2°С.

Технической задачей данного изобретения является создание более продуктивной технологии получения стабильного препарата очищенного рчГ-КСФ с улучшенным качеством, пригодного для создания лекарственного препарата медицинского назначения.

Увеличение продуктивности достигается за счет применения оптимальной схемы отмывки телец включения, введения контроля над процессом ренатурации и оптимизации условий ренатурации.

Улучшение качества достигается за счет введения дополнительной стадии хроматографической очистки рчГ-КСФ на анионобменнике (ДЭАЭ-сефароза) при рН 7-9, замены катионообменного сорбента (ввели SO₃-фрактогель вместо SP-сефадекса) и изменения схемы элюции с катиоонообменного сорбента.

Повышение стабильности достигается за счет диализа очищенного препарата рчГ-КСФ против буфера с рН 4-5, добавления в раствор белка полисахаридов, или многоатомных спиртов, или поливинилпирролидонов, или моносахаридов, или аминосахаров, или белков, или аминокислот и неионных детергентов и его хранения в полимерных или стеклянных емкостях с силиконизированной поверхностью при температуре 4±2°С.

Поставленная задача решается тем, что клетки Е. coli SG20050 или любые производные этого штамма трансформируют плазмидой pGGF8 [26]. Трансформированные клетки Е. coli/pGGF8, выращенные как описано ранее [27], разрушают при помощи Френч-пресса или ультразвука при температуре 6±3°С. Тела включения, содержащие рчГ-КСФ, отделяют от фракции растворимых клеточных белков при помощи центрифугирования. Для удаления примесных бактериальных белков тела включения отмывают буферным раствором с рН 7-9, содержащим детергенты и 2 М мочевину. Отмытый осадок тел включения растворяют в буферном растворе с рН 7-9, содержащем 8 М мочевину и 10-30 мМ 2-меркаптоэтанола или 2-5 мМ дитиотриэтола. Ренатурацию восстановленного рчГ-КСФ проводят разбавлением буферным раствором с рН 7-9, содержащим детергенты, глицерин и этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) до концентрации суммарного белка 0,3-0,1 мг/мл при температуре 4-20°С в течение 20-48 часов или при помощи диализа восстановленного рчГ-КСФ против буферного раствора с рН 7-9, содержащего детергенты, глицерин и ЭДТА при температуре 4-20°С в течение 20-48 часов.

После окончания процесса ренатурации полученный раствор окисленного белка пропускают через колонку с анионообменным сорбентом, уравновешенную буферным раствором с рН 7-9. К объединенным фракциям, не связавшимся с сорбентом, добавляют уксусную кислоту до рН 4-5, и полученный раствор наносят на две соединенные последовательно и уравновешенные буферным раствором с рН 4-5 (буфер “А”), колонки с анионообменным и катионообменным сорбентами. Колонку промывают буфером “А”, содержащим 0,2 М NaCI, и рчГ-КСФ элюируют с катионообменного сорбента линейным градиентом NaCI от 0,2 до 1,0 М в буфере “А”. Фракции, содержащие рчГ-КСФ, объединяют и диализуют против буферного раствора с рН 4-5, добавляют неионные детергенты и полисахариды, или многоатомные спирты, или поливинилпирролидоны, или моносахариды, или аминосахара, или белки, или аминокислоты и хранят в полимерных или стеклянных емкостях с силиконизированной поверхностью при 4±2°С.

В качестве детергентов используют неионные, ионные и амфотерные детергенты. В качестве неионных детергентов используют тритон Х-100, твин-80, твин-20 или их смесь, в качестве ионных детергентов используют дезоксихолат (ДОХ) натрия, цетилтриметил-аммониумбромид (ЦТАВ), или их смесь, в качестве амфотерных детергентов используют 3-[(3-холамидопропил) диметиламино]-1-пропансульфонат (CHAPS), 3-[(3-холамидопропил) диметиламмоний]-2-гидрокси-1 пропансульфонат (CHAPSO) или их смесь.

Выход электрофоретически гомогенного рчГ-КСФ с чистотой 98% составляет 36-40 мг из 1 л культуры клеток Е. coli штамма SG20050 или любых производных штамма SG20050, трансформированных плазмидой pGGF8. Специфическая (гемостимулирующая) активность полученного препарата рчГ-КСФ, определенная in vivo на мышах, у которых путем введения цитостатика воспроизводилась гипоплазия кроветворения, составляет 600-1000%. Специфическая активность, определенная in vitro по стимуляции мышиных клеток M-NFS-60, составляет 10⁸ МЕ/мг белка. Содержание белков штамма-продуцента составляет менее 30 нг/мг рчГ-КСФ, что в 6 раз меньше, чем в рчГ-КСФ, полученном в способе-прототипе. Содержание ДНК составляет менее 10 пкг/мг рчГ-КСФ, что в 8 раз меньше, чем в способе прототипе.

Предлагаемая схема позволяет получать стабильные препараты рчГ-КСФ с высоким выходом и высокой чистотой, что позволяет использовать их в качестве субстанции в фармацевтической промышленности для создания лекарственных препаратов нового поколения для медицины, а также для косметологии, ветеринарии и научных исследований.

Новым по сравнению со способом-прототипом является:

– введение оптимальной схемы отмывки тел включения буфером, содержащим детергенты и низкие концентрации мочевины (вместо использования отмывки с 1М LiCI с мочевиной в способе-прототипе).

– оптимизация условий ренатурации, в частности:

1. Проведение ренатурации рчГ-КСФ разбавлением восстановленного раствора тел включения буферным раствором с рН 7-9, содержащим детергенты, глицерин и ЭДТА или диализом восстановленного раствора тел включения против 10 объемов буферного раствора с рН 7-9, содержащего детергенты, глицерин, ЭДТА и 0,4-0,8 М мочевину (вместо разбавления нейтральным буфером, содержащим ЭДТА в способе-прототипе).

2. Увеличение времени ренатурации до 48 часов при 4°С или до 24 часов при 20°С (вместо 24 часов при 4°С часов в способе-прототипе. Ренатурация при 20°С в способе-прототипе отсутствует).

– Введение дополнительной хроматографической стадии очистки рчГ-КСФ на анионообменнике при рН 7-9 (Эта стадия очистки рчГ-КСФ в способе-прототипе отсутствует).

– Изменение катионообменного сорбента. Использование SO₃-фрактогеля вместо SP-сефарозы в способе-прототипе.

– Изменение схемы элюции с катионнообменного сорбента: введение этапа промывки сорбента буферным раствором с рН 4-5, содержащим 0,2 М NaCI, и последующей элюцией рчГ-КСФ линейным градиентом концентрации NaCI от 0,2 до 1,0 М (В способе-прототипе – этап промывки сорбента 0,02 М натрий ацетатным буфером, содержащим 0,2 М NaCI отсутствует).

– Проведение диализа очищенного белка против буферного раствора с рН 4-5 в отсутствие NaCI и добавления в полученный диализат полисахаридов, или многоатомных спиртов, или поливинилпирролидонов, или моносахаридов, или аминосахаров, или белка, или аминокислот и неионных детергентов (В способе-прототипе диализ очищенного белка проводят против 50 мМ натрий-ацетатного буфера рН 4,4-4,5, содержащего 0,1 М NaCI, без последующего добавления стабилизаторов в раствор белка).

Введенные изменения позволяют повысить выход, качество и стабильность препарата рчГ-КСФ.

Предлагаемый способ осуществлен с использованием штамма-продуцента, полученного трансформацией клеток E.coli штамма SG20050 (или любых производных штамма E.coli SG20050) плазмидой pGGF8 [26].

Биомасса трансформированных клеток получена, как описано ранее [27].

Клетки разрушают при помощи Френч-пресса или ультразвука, центрифугируют и осадок тел включения последовательно отмывают буферным раствором, содержащим детергенты и низкие концентрации мочевины.

Эта схема отмывки тел включения позволяет избирательно удалить из тел включения бактериальные белки и ДНК практически без потерь целевого продукта. Отмытые тела включения растворяют в буферном растворе с рН 7-9, содержащем 6-8 М мочевину или 6 М гуанидинхлорид, и 10-30 мМ 2-меркаптоэтанола или 2-5 мМ дитиотриэтола до концентрации суммарного белка 1-3 мг/мл. Ренатурацию проводят при помощи разбавления полученного раствора восстановленного белка фосфатным буфером, рН 7-9, содержащим детергенты, глицерин и ЭДТА, до концентрации суммарного белка 0,3-0,1 мг/мл. Альтернативно ренатурацию проводят диализом полученного раствора восстановленного белка против 10 объемов фосфатного буфера, рН 7-9, содержащего детергенты, глицерин, ЭДТА и 0,4-0,8 М мочевины. Время ренатурации составляет от 20 до 48 час при температуре 4-20°С. Например, при температуре 6±3°С и 20±3°С время ренатурации составляет 48±3 часа и 24±3 часа соответственно. Снижение концентрации денатурирующих агентов – мочевины и гуанидинхлорида – и окисление восстановленных SH-групп белка растворенным кислородом при диализе или разбавлении раствора денатурированного восстановленного белка приводит к сворачиванию белка в правильную конформацию (ренатурация), в результате чего в рчГ-КСФ происходит образование внутримолекулярных дисульфидных связей. Известно, что молекула Г-КСФ содержит две внутримолекулярные дисульфидные связи Cys³⁶-Sys⁴² и Sys⁶⁴-Sys⁷⁴ и свободную сульфгидрильную группу в Cys¹⁷ [28]. Показано, что ренатурация рчГ-КСФ происходит в два этапа, с образованием частично ренатурированного продукта: сначала очень быстро проходит образование дисульфидной связи Cys³⁶-Sys⁴², и только затем очень медленно формируется вторая дисульфидная связь Sys⁶⁴ -Sys⁷⁴ [29-30]. Поскольку денатурированный рчГ-КСФ содержит 5 цистеинов в восстановленной форме, он отличается по ряду свойств от частично ренатурированного рчГ-КСФ, который содержит 2 цистеина с окисленными группами (одна дисульфидная связь) и 3 цистеина в восстановленной форме и полностью ренатурированного рчГ-КСФ (содержит 4 цистеина в окисленной форме (две дисульфидные связи) и 1 цистеин в восстановленной форме, поэтому можно ввести контроль за образованием полностью ренатурированного рчГ-КСФ с помощью метода электрофореза в полиакриламидном геле в невосстанавливающих (в отсутствие 2-меркаптоэтанола) условиях. Окисленные и восстановленные формы рчГ-КСФ, обработанные иодацетамидом, имеют различную электрофоретическую подвижность. Условия, при которых более 90% рчГ-КСФ было представлено полностью окисленной ренатурированной формой, считали оптимальными. Процесс ренатурации проводят при рН 8-9, так как в этих условиях тиоло-дисульфидный обмен может происходить достаточно быстро без добавления экзогенных тиоловых групп [31]. Ренатурацию проводят в присутствии детергентов и глицерина, так как ранее было показано, что введение в ренатурационный буфер детергентов и глицерина повышает эффективность ренатурации некоторых рекомбинантных белков [32-33].

После окончания процесса ренатурации проводят очистку белка при помощи ионообменной хроматографии при разных рН. На первой стадии проводят хроматографию при рН 7-9 на анионообменном сорбенте (ДЭАЭ-сефарозе). В этих условиях с сорбентом связываются высокомолекулярные нуклеиновые кислоты и основная часть бактериальных белков, при этом рчГ-КСФ с сорбентом не связывается. Далее проводят рН-фракционирование раствора, содержащего рчГ-КСФ, снижая рН буфера до 4-5. При этом тиол-дисульфидный обмен замедляется и неправильно свернутые формы и олигомеры рчГ-КСФ выпадают в осадок. Полученную суспензию фильтруют и для окончательной очистки рчГ-КСФ проводят хроматографию полученного фильтрата при рН 4-5 одновременно на двух последовательно соединенных колонках: первая с анионообменным сорбентом (ДЭАЭ-сефарозой), вторая с катионообменным сорбентом (SO₃-фрактогелем). Использование анионообменного сорбента при рН 4-5 позволяет сорбировать из раствора липополисахариды, низкомолекулярные нуклеиновые кислоты и оставшиеся бактериальные белки. При рН 4-5 рчГ-КСФ связывается с катиоонообменным сорбентом. Остаточные примеси бактериальных белков, также связавшиеся с катионообменным сорбентом, элюируют буферным раствором, содержащим градиент концентрации NaCI от 0,05 до 0,2 М. Элюцию рчГ-КСФ проводят градиентом концентрации хлористого натрия от 0,2 до 1,0 М в буферном растворе с рН 4-5. Очищенный препарат рчГ-КСФ диализуют против 3-15 мМ буферного раствора с рН 4-5, добавляют полисахариды, или многоатомные спирты, или поливинилпирролидоны, или моносахариды, или аминосахара, или белки, или аминокислоты и неионные детергенты и хранят в пластиковых или стеклянных флаконах с силиконизированной поверхностью при температуре 4±2 °С.

Использование приведенного выше способа позволяет получать высокоочищенные стабильные препараты рчГ-КСФ с выходом 32-40 мг на л культуры клеток (на 30% выше по сравнению со способом-прототипом).

Предлагаемое изобретение иллюстрируется фигурами графического изображения, где представлены:

Фиг.1. Электрофоретический анализ белков в 12% полиакриламидном геле в присутствии SDS в ходе получения и отмывки нерастворимых тел включения.

Фиг.2. Кинетика ренатурации рчГ-КСФ при температуре 6±3°С.

Фиг.3. Кинетика ренатурации рчГ-КСФ при температуре 20±3°С.

Фиг.4 Хроматография рчГ-КСФ и бактериальных белков при рН 4,5 на колонке с катионообменником (SO₃-фрактогель).

Фиг.5. Электрофоретический анализ очищенного рчГ-КСФ.

Примеры конкретного выполнения способа приведены ниже:

Пример 1. Разрушение клеток E.coli SG20050/pGGF8 и получение тел включения. 10 г биомассы штамма-продуцента E.coli SG20050/pGGF8 суспендируют в 100 мл 10 мМ трис-HCl, рН 8, содержащем 0,14 М NaCI, 0,02 М ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ингибитор протеиназ). Клетки разрушают при помощи Френч-пресса или ультразвука и суспензию центрифугируют 20 мин при температуре 4°С. Осадок тел включения содержит бактериальные белки и рчГ-КСФ (фиг.1А, трек 3). Супернатант, полученный после центрифугирования разрушенных клеток, содержит только бактериальные белки (фиг.1А, трек 2).

Пример 2. Разрушение клеток E.coli SGK25/pGGF8 и получение тел включения. 10 г биомассы штамма-продуцента E.coli SGK25/pGGF8 суспендируют в 100 мл 10 мМ трис-HCl, рН 8, содержащем 0,14 М NaCI, 0,02 М ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида. Клетки разрушают при помощи Френч-пресса или ультразвука и суспензию центрифугируют 20 мин при температуре 4°С. Осадок тел включения содержит бактериальные белки и рчГ-КСФ.

Пример 3. Отмывка бактериальных белков из тел включения буфером, содержащим неионные детергенты.

Тела включения, полученные в примерах 1 и 2, отмывают 10 мМ трис-HCl, рН 8, содержащим 2 М мочевину и ионные детергенты: тритон Х-100, или твин-80, или твин-20, или их смесь. Промывочные растворы содержат набор бактериальных белков, но не содержат рчГ-КСФ (фиг.1Б, треки 1, 2, 3, 4). Содержание рчГ-КСФ в отмытых телах включения составляет 74% от суммарного белка (фиг.1Б, трек 5).

Пример 4. Отмывка бактериальных белков из тел включения буфером, содержащим ионные детергенты.

Тела включения, полученные в примерах 1 и 2, отмывают 10 мМ трис-HCl, рН 8, содержащим 2 М мочевину и ионные детергенты: ДОХ, или ЦТАБ, или их смесь. Промывочный раствор содержит набор бактериальных белков, но не содержит рчГ-КСФ (фиг.1В, треки 1, 2 и 3). Содержание рчГ-КСФ в отмытых телах включения составляет 83% от суммарного белка (фиг.1В, трек 4).

Пример 5. Отмывка бактериальных белков из тел включения буфером, содержащим амфотерные детергенты.

Тела включения, полученные в примерах 1 и 2, отмывают 10 мМ трис-HCl, рН 8, содержащим 2 М мочевину и амфотерные детергенты:CHAPS, или CHAPSO, или их смесь. Промывочный раствор содержит набор бактериальных белков, но не содержит рчГ-КСФ (фиг.1Г, треки 1, 2 и 3). Содержание рчГ-КСФ в отмытых телах включения составляет 70% от суммарного белка (фиг.1Г, трек 5).

Пример 6. Определение содержания рчГ-КСФ.

Содержание рчГ-КСФ определяют по отношению к суммарному клеточному белку. Анализируемые образцы с известной концентрацией белка суспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 125 мМТрис-HCl, рН 6,8, 20% глицерин, 3% SDS, 3% меркаптоэтанол, 0,005% бромфеноловый синий, нагревают 10 мин на кипящей водяной бане и охлаждают во льду; вносят в лунки по 2, 5 и 10 мкл каждого образца и подвергают электрофорезу в 12,5% SDS-ПААГ. По окончании электрофореза гель окрашивают при помощи кумасси R-250. После отмывки избытка красителя гель сканируют при помощи сканера ScanJet 5300C. В исследуемых пробах определяют концентрацию суммарного клеточного белка, общий белок, содержание рчГ-КСФ, общее количество рчГ-КСФ и выход рчГ-КСФ относительно суммарного белка при помощи программы Gel-Pro 3.1.

Пример 7. Растворение тел включения в мочевине и восстановление белка. Осадок тел включения, полученный в примерах 3 или 4 или 5, суспендируют в 300 мл 10 мМ трис-HCl, рН 8, содержащего 8 М мочевину и интенсивно перемешивают до прозрачности. В растворе определяют концентрацию белка. К раствору добавляют 10 мМ трис-HCl буфер, рН 8, содержащий 8 М мочевину, до концентрации белка 1-3 мг/мл. Для восстановления белка добавляют 2-меркаптоэтанол до концентрации 20 мМ или дитиотриэтол до концентрации 3 мМ и смесь оставляют на 18-20 часов при комнатной температуре 18-20°С

Пример 8. Растворение тел включения в гуанидинхлориде и восстановление белка. Полученный в примерах 3 или 4 или 5 осадок суспендируют в 300 мл 10 мМ трис-HCl, рН 8, содержащего 6 М гуанидинхлорид, и интенсивно перемешивают до прозрачности. В растворе определяют концентрацию белка. К раствору добавляют 10 мМ трис-HCl буфер, рН 8, содержащий 6 М гуанидинхлорид, до концентрации белка 1-3 мг/мл. Для восстановления белка добавляют 2-меркаптоэтанол до концентрации 20 мМ или дитиотриэтол до концентрации 3 мМ и смесь оставляют на 18-20 часов при комнатной температуре 18-20°С.

Пример 9. Ренатурация рчГ-КСФ после растворения тел включения в буферном растворе, содержащем 8М мочевину.

Раствор восстановленного белка, полученный в примере 7, охлаждают до температуры 6±3°С и добавляют 9 объемов 10 мМ натрий фосфатного буфера, рН 8, содержащего неионные детергенты (твин-20 или твин-80), 0,4% глицерина и 10 мМ ЭДТА, охлажденного до указанной температуры. Полученную смесь выдерживают при температуре 6±3°С в течение 48±2 часа или при температуре 20±3°С в течение 24±2 часа.

Пример 10. Ренатурация рчГ-КСФ после растворения тел включения в буферном растворе, содержащем 6М гуанидинхлорид. Раствор восстановленного белка, полученного в примере 8, диализуют 2 раза против 10 объемов 10 мМ натрий фосфатного буфера, рН 8, содержащего детергенты, 0,4% глицерина, 10 мМ ЭДТА и 0,5 М мочевины, при температуре 20±3°С или 6±3°С в течение 24±2 или 48±2 часа соответственно.

Пример 11. Подбор условий ренатурации.

Для контроля за эффективностью ренатурации из раствора, полученного в примере 9, через определенные интервалы времени отбирают аликвоты, добавляют уксусную кислоту до рн 4,5 и центрифугируют. К супернатанту добавляют 1/3 объема буфера, содержащего 125 мМ Трис-НСЕ, рН 6,8, 20% глицерин. 3% SDS 0,005% бромфеноловый синий, и нагревают 3 мин на кипящей водяной бане. К пробам добавляют 1/10 объема 3 М раствора йодацетамида, инкубируют 30 мин при комнатной температуре и вносят в лунки по 50-100 мкл и подвергают электрофорезу в 12,5% SDS-ПААГ. По окончании электрофореза гель окрашивают при помощи Кумасси R-250. После отмывки избытка красителя гель сканируют при помощи сканера ScanJet 5300C. Кинетика ренатурации рчГ-КСФ при температуре 6±3°С и 20±3°С представлена на фиг.2 и 3 соответственно. Исходя из полученных данных видно, что ренатурация заканчивается через 48±2 часа и через 24±2 часа при температуре 6±3°С и 20±3°С соответственно.

Пример 12. Хроматография рчГ-КСФ на анионообменном сорбенте при рН 8. Раствор ренатурированного белка, полученный в примере 9, центрифугируют или фильтруют. Надосадочную жидкость разбавляют в два раза 10 мМ натрий фосфатным буфером, рН 8 и наносят на колонку (20 мл) с анионообменным сорбентом (ДЭАЭ-сефароза), уравновешенную тем же буфером. Фракцию, содержащую белки, не связавшиеся с сорбентом, собирают, колонку промывают 10 мМ натрий фосфатным буфером, рН 8, и белки, связавшиеся с сорбентом, элюируют 1,0 М NaCI. Все фракции анализируют при помощи электрофореза в денатурирующих условиях в 12,5% ПААГ и при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) для определения примесных бактериальных белков. Как показали результаты эксперимента (табл.1), при рН 8 рчГ-КСФ не связывается с анионообменным сорбентом в отличие от бактериальных белков, связавшихся с анионообменным сорбентом и элюирующихся с колонки 1 М NaCI. Аналогичные результаты были получены при хроматографии на анионообменном сорбенте при рН 8 раствора ренатурированного белка, полученного в примере 10. К белковому раствору, не связавшемуся с сорбентом, содержащему рчГ-КСФ, добавляют уксусную кислоту до рН 4,5, инкубируют 2 часа при температуре 6±3°С и фильтруют.

Пример 13. Очистка рчГ-КСФ при помощи ионообменной хроматографии на анионообменном и катионообменном сорбенте при рН 4,5.

Фильтрат, полученный в примере 12, наносят на соединенные последовательно колонки с анионообменным (ДЭАЭ-сефароза, 100 мл) и катиоонообменным (SO₃-фрактогель, 20 мл) сорбентами, уравновешенными 20 мМ натрий ацетатным буфером, рН 4,5 (буфер “А”). После нанесения колонку с анионообменным сорбентом отсоединяют, колонку с SO₃-фрактогелем промывают последовательно буфером “А” и буфером А, содержащим градиент концентрации NaCI от 0,05 до 0,2 М. Элюцию сорбированного на с SO₃-фрактогеле рчГ-КСФ проводят линейным градиентом хлористого натрия от 0,2 до 1,0 М в буфере “А”. Фракции анализируют электрофорезом в денатурирующих условиях в 12,5% ПААГ и ИФА для определения примесных бактериальных белков. Для этого из каждой фракции отбирают аликвоты по 100 мкл и проводят ИФА, как описано в работе [34]. Как показали результаты эксперимента (фиг.4), примесные бактериальные белки элюируются при концентрации NaCI, меньшей чем 0,2 М, тогда как рчГ-КСФ начинает элюироваться при концентрации NaCI больше, чем 0,4 М. Фракции, содержащие рчГ-КСФ, объединяют. Выход целевого белка составляет 130 мг. Суммарные данные по очистке и выходу рчГ-КСФ из 10 г биомассы приведены в таблице 2.

Табл.2. Очистка и выход рчГ-КСФ из 10 г биомассы E.coli /pGGF8
Стадия	Объем (мл)	Суммарный белок		Г-КСФ		Выход Г-КСФ (%)
		Концентрация (мг/мл)	Количество (мг)	Содержание (%)	Количество (мг)
Тела включения	360	1,0	360	60	216	100
Проба после ренатурации	3600	0,069	248	70	174	80
Проба после ионообменной хроматографии при рН 8	3800	0,054	205	80	164	76
Проба после ионообменной хроматографии при рН 4,5	200	0,65	130	98	130	60

Электрофоретическая чистота полученного белка рчГ-КСФ в редуцирующих и нередуцирующих условиях при нагрузке на лунку 40 мкг составляет более 98% (Фиг.5, треки 2 и 3 соответственно).

Пример 14. Стабилизация очищенного рчГ-КСФ. Объединенные фракции, содержащие очищенный рчГ-КСФ, полученные в примере 13, диализуют против 20 объемов 5 мМ натрий ацетатного буфера, рН 4,5 при температуре 6±3°С. Полученный диализат помещают в пластиковые или стеклянные флаконы с силиконизированной поверхностью, добавляют твин-80 до конечной концентрации 0,002% и добавляют стабилизаторы – полисахариды, или многоатомные спирты, или поливинилпироллидоны, или моносахариды, или аминосахара, или белки, или аминокислоты и хранят при температуре 6±3°С. В качестве полисахарида используют декстран-60 в концентрации 3-6%, в качестве многоатомного спирта используют полиэтиленгликоль 1500 в концентрации 2-5%, в качестве поливинилпиролидона используют поливинилпирролидон-12000 в концентрации 3-6%, в качестве моносахарида используют маннит в концентрации 4-7%, в качестве аминосахаров используют глюкозамин в концентрации 6-10%, в качестве белка используют человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в концентрации 1%, в качестве аминокислоты используют L-аргинин в концентрации 2-6%. Через 12 месяцев отбирают аликвоты и анализируют биологическую активность рчГ-КСФ. В таблице 3 приведены данные по хранению препаратов рчГ-КСФ с тестированием активности методом in vivo на мышах, у которых путем введения циклофосфана была вызвана миелосупрессия. Результаты эксперимента показали, что при хранении в присутствии NaCI активность рчГ-КСФ через 12 месяцев уменьшалась более чем в два раза (табл.3). При добавлении стабилизаторов – полисахариды, или многоатомные спирты, или поливинилпироллидоны, или моносахариды, или аминосахара, или белки, или аминокислоты – активность рчГ-КСФ сохранялась в течение 12 месяцев.

Пример 15. Определение биологической активности препарата рчГ-КСФ in vivo и in vitro.

Гемостимулирующую (гранулоцитопоэзстимулирующую) активность полученного препарата in vivo определяли на мышах, у которых путем введения цитостатика воспроизводилась гипоплазия кроветворения. Биологическую активность in vitro определяли по стимуляции мышиных клеток M-NFS-60. Для тестирования активности препарата in vivo использовали 12 мышей-самцов линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Все 12 животных получали однократно внутрибрюшинно циклофосфан в максимально переносимой дозе – 250 мг/кг в 0,2 мл раствора натрия хлорида 0,9% для инъекций (раствор 1). Через 24 ч после инъекции цитостатика шести опытным мышам начинали вводить препарат субстанции рчГ-КСФ в дозе 125 мкг/кг в 0,2 мл раствора 1 подкожно ежедневно в течение четырех дней. Контрольным животным (оставшимся шести мышам) после цитостатика вводили четырехкратно в эквивалентном объеме раствор 1. Специфическая активность полученного препарата рчГ-КСФ in vivo составляла 840-1000% (табл.4). Биологическая активность полученных препаратов рчГКСФ in vitro, определенная по стимуляции мышиных клеток M-NFS60, составляет 10⁸ МЕ/мг белка (табл.5).

Таблица 5. Активность очищенных препаратов рчГ-КСФ in vitro на клетках M-NFS60 (Специфическая активность в МЕ/мг белка).
рчГ-КСФ (№образца)	Концентрация белка (мг/мл)	Активность, (МЕ/мг белка).
1	1,01	108
2	0,59	108

Пример 16. Определение неспецифических примесей (ДНК и бактериальных белков) в препарате очищенного рчГ-КСФ.

Примеси белков штамма-реципиента E.coli SG20050 или любых производных этого штамма определяли иммуноферментным анализом с использованием поликлональных антител к белкам Е. coli SG20050 [34].

Примеси ДНК определяли гибридизацией [35]. Результаты определения содержания ДНК и бактериальных белков представлены в таблице 6. Полученные данные указывают на то, что содержание ДНК и бактериальных белков в препарате очищенного рчГ-КСФ снизилось примерно в 6-8 раз по сравнению с препаратом, полученным в способе-прототипе.

Табл.6. Определение неспецифических примесей в препарате очищенного рчГ-КСФ.
рчГ-КСФ (№образца)	Концентрация белка мг/мл	Примеси бактериальных белков, нг/мг Г-КСФ	Примеси ДНК пкг/мг Г-КСФ
1	0,65	25	0
2	0,7	30	10
3	0,8	30	10
4	0,56	25	0

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что использование предлагаемого способа позволяет получать стабильные препараты рчГ-КСФ с более высоким выходом и более высокой чистотой по сравнению со способом-прототипом. Полученный препарат рчГ-КСФ соответствует требованиям, предъявляемым Минздравом к медицинским иммунобиологическим препаратам, полученным методами генетической инженерии [36], что позволяет использовать его в качестве субстанции в фармацевтической промышленности для создания лекарственных препаратов нового поколения для медицины, а также для косметологии, ветеринарии и научных исследований.

Источники информации

23. Патент США, №4810643, 07.04.1989.

25. Патент РФ 2201962, кл. C 12 N 15/27, опубл. БИ-ХХ, 2003 г.

26. Патент РФ 2113483, кл. С 12 N 15/27, опубл. БИ 17. 1998 г.

27. Патент РФ 2158303, кл. С 12 N 1/21, опубл. БИ 30, 2000 г.

34. Афиногенова Г.Н., Гладченко Т.Н., Веревкина К.Н., Пустошилова Н.М. Сборник трудов научных сотрудников НИКТИ БАВ, Бердск, 1999 г.

35. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. Методические указания, МУК 4.1/4.2/588-96, M., 1998.

36. Общие требования к медицинским иммунобиологическим препаратам, полученным методами генной инженерии. РД 42-68-9-89, M., 1989.

Формула изобретения

1. Способ получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (рчГ-КСФ), пригодного для медицинского применения, из нерастворимых тел включения рекомбинантных клеток Е. coli, трансформированных плазмидой pGGF8, содержащей ген Г-КСФ человека, предусматривающий разрушение бактериальных клеток, выделение тел включения, удаление примесных белков, растворение тел включения, восстановление, ренатурацию, хроматографическую очистку и стабилизацию рчГ-КСФ, при этом удаление примесных белков из тел включения проводят нейтральным буферным раствором, содержащим детергенты и мочевину, растворение тел включения проводят 6-8 М мочевиной или 4-6 М гуанидинхлоридом, восстановление проводят 2-меркаптоэтанолом или дитиотриэтолом, ренатурацию восстановленного рчГ-КСФ проводят разбавлением нейтральным буфером с рН 7-9, содержащим детергенты, глицерин и этилендиаминтетрауксусную кислоту до концентрации суммарного белка 0,3-0,1 мг/мл при температуре 4-20°С в течение 20-48 ч или при помощи диализа восстановленного рчГ-КСФ против буфера с рН 7-9, содержащего детергенты, глицерин и ЭДТА при температуре 4-20°С в течение 20-48 ч, хроматографическую очистку рчГ-КСФ осуществляют при помощи ионообменной хроматографии при разных рН в две стадии, сначала на анионообменном сорбенте при рН 7-9 и затем на последовательно соединенных анионообменном и катионообменном сорбентах при рН 4-5 с последующим элюированием целевого белка с катионообменного сорбента в линейном градиенте хлористого натрия (от 0,2 до 1,0 М) в буфере с рН 4-5 и стабилизацию рчГ-КСФ осуществляют при помощи диализа против буфера с рН 4-5 с последующим добавлением к раствору рчГ-КСФ полисахаридов, или многоатомных спиртов, или поливинилпирролидонов, или моносахаридов, или аминосахаров, или белка, или аминокислот и детергентов.

2. Способ по п.1, где в качестве детергента используют неионные, ионные или амфотерные детергенты или их смесь.

3. Способ по п.1, где полученный рчГ-КСФ хранят в полимерных или стеклянных емкостях с силиконизированной поверхностью при (4±2)°С.

4. Иммунобиологическое средство, стимулирующее гемопоез, представляющее собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека, полученный, выделенный, очищенный и стабилизированный в соответствии с пп.1-3.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 31.08.2008

Извещение опубликовано: 10.07.2009 БИ: 19/2009

NF4A – Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.07.2009

Извещение опубликовано: 20.07.2009 БИ: 20/2009