Патент на изобретение №2278379
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ КОЛОНОК С ПОЛИМЕРНЫМИ СОРБЕНТАМИ ДЛЯ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
(57) Реферат:
Использование: жидкостная хроматография, приготовление высокоэффективных колонок с полимерными сорбентами. Сущность изобретения: для приготовления высокоэффективных колонок с полимерными сорбентами готовят суспензию сорбента в водном растворе щелочи с рН=11-14 с выдержкой 0,5-60 часов, упаковку и уплотнение сорбента в колонке осуществляют также в водном растворе щелочи. Изобретение повышает эффективность эксплуатации колонок. 2 з.п. ф-лы, 5 ил.
Изобретение относится к жидкостной хроматографии и может быть использовано для получения эффективных колонок для разделения биополимеров, для экспресс-контроля молекулярно-массового распределения (ММР) олигомеров этоксисилоксанов в гидролизованных и негидролизованных этилсиликатах, а также для других случаев хроматографических процессов. Для приготовления современных высокоэффективных колонок широко используют полимерные сорбенты на основе полистирола (ПС) и полистирол-дивинилбензола (ПС-ДВБ) с высокой степенью сшивки, причем существующие технологии позволяют получать мелкие фракции моносферических зерен диаметром 3-10 мкм [1, 2]. Полимерные сорбенты, используемые в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), должны обладать определенными свойствами по параметрам величин: механической прочности, изменению объема в органических и водно-органических средах, диаметру пор, распределению пор по размеру, удельной поверхности и гидрофобности. В большинстве случаев, из вышеперечисленных характеристик, определяющих применимость полимерного сорбента в ВЭЖХ, основными являются его механическая прочность и степень набухания в органических и водно-органических средах. Синтезированные по патенту [2] моносферические гранулы полимерного сорбента на основе ПС-ДВБ, упакованные в хроматографическую колонку, изменяют объем при набухании в дихлорметане (хороший растворитель) на 9-20%, а в 50% растворе метанола в воде (плохой растворитель) на 0,03-0,15%. Хроматографические колонки, упакованные моносферическими гранулами диаметром 3 мкм полимерного сорбента на основе ПС-ДВБ, имеют эффективность более 50000 теоретических тарелок/метр (т.т./м) [2]. Но в патенте [2] не указаны тип используемого растворителя для приготовления суспензии сорбента и условия методики приготовления колонок. Следует отметить ряд свойств, которые принципиально отличают сорбенты на основе сверхсшитого полистирола (ССПС) от всех известных полимерных сорбентов. Сухой ССПС набухает в любых растворителях, независимо от их параметра растворимости [3, 4]. Начиная с 20% степени сшивки, полимеры этого типа проявляют способность набухать в метаноле, этаноле и гексане. В настоящее время фирма Purolite, Великобритания, выпускает ряд ССПС сорбентов как гидрофобных, так и содержащих катионо- и анионообменные группы, под общим названием Macronet (MN). Их характеристики представлены в [5]. Эти сорбенты предназначены для извлечения органических соединений из вод в промышленных масштабах. Из зерен немодифицированного гидрофобного сорбента MN-200 можно получать мелкие частицы, пригодные для ВЭЖХ, имеющие диаметр макропор 850-950 å и микропор 15 å, работающие при рН 0-14. Среди ССПС для ВЭЖХ, наиболее изучена химическая структура MN-200 [6], которая исследована в работе [7]. ССПС MN-200 по сравнению с сорбентом на основе ПС-ДВБ имеет меньшее набухание в тетрагидрофуране в 3,9 раза и ацетонитриле в 8,7-12 раз [6, стр.6]. Одним из уникальных свойств немодифицированного ССПС является то, что, несмотря на высокую гидрофобность этого сорбента, его поверхность смачивается водой. Проведенные исследования показали, что поверхность ССПС MN-200 имеет заряд, причем и величина, и знак заряда определяются рН раствора, в котором находится сорбент [7]. В соответствии с зависимостью дзета-потенциала ( По данным элементного анализа, наряду с углеродом и водородом MN-200 содержит небольшое количество хлора и около 6% кислорода. Таким образом, наличие положительного заряда на поверхности немодифицированного ССПС можно объяснить только присутствием атомов кислорода в структуре полимерной матрицы. Природа функциональных групп на поверхности MN-200 была исследована методами твердофазного ЯМР 13С, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии и ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием [7, 8]. Установлено, что на поверхности ССПС находятся кетонные, эфирные (R-O-R) и функциональные спиртовые группы, точную концентрацию каждой из которых определить не удается. Потенциометрическое титрование MN-200 показало, что на его поверхности помимо карбонильных, присутствуют катионообменные группы трех типов: слабо и сильно кислые, а также фенольные [6, стр.87]. В работе [6, с.53] заполнение колонок ССПС MN-200 осуществляли в виде суспензии в ацетоне, но других условий методики заполнения колонок не приведено. В работе [9, с.89] заполнение колонок нейтральным ССПС марки Chromalite 5 HGN осуществляли в виде суспензии, но какие использовали растворители и условия методики заполнения колонок не приведено. У сорбентов типа Колонки для ВЭЖХ с полимерными сорбентами на основе сополимера стирола и дивинилбензола с диаметром гранул 10 мкм и диаметром пор 500 å, 1000 å имеют следующую эффективность (тыс. т.т./м): Как видно, колонки для ВЭЖХ с полимерными сорбентами на основе сополимера стирола и дивинилбензола имеют различную эффективность, которая в большой степени зависит от методики заполнения колонок. Учитывая, что сверхсшитые полимерные сорбенты на основе полистирола, полидивинилбензола и полистирола-дивинилбензола не набухают в воде, казалось бы, что вода – идеальный элюент для набивки колонок. Однако в водном элюенте эти сорбенты не образуют суспензии и в нем не разрушаются агломераты зерен сорбентов, что препятствует плотной упаковке сорбентов в колонках для ВЭЖХ. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому способу, выбранному в качестве ближайшего аналога, является способ приготовления колонок для ВЭЖХ суспензионным методом, включающий: взвешивание требуемого для колонки данного размера количества сорбента, заливку его растворителем и приготовление суспензии. Суспензию помещают в резервуар, соединенный с колонкой, на конце которой установлен фитинг с фильтром, и под давлением 20-60 МПа продавливают суспензию через колонку, подавая в резервуар насосом растворитель. Суспензию отфильтровывают на фильтре колонки, формируя упорядоченный слой сорбента, обеспечивающий эффективное разделение при ВЭЖХ. Останавливают поток растворителя, дают давлению упасть до нуля и снимают колонку. Удаляют избыток сорбента с конца колонки и присоединяют второй фитинг с фильтром. Полученную таким образом колонку устанавливают на хроматограф, прокачивают через нее до установления равновесия рабочий растворитель, после чего она готова к работе [10, стр.151]. Растворитель для приготовления суспензии сорбента часто является определяющим фактором для качества упаковки колонки, так как суспензия должна сохранять стабильность, начиная от переноса ее в резервуар и в течение всей упаковки, или необходимо замедлить седиментацию или исключить ее. Растворители с сорбентами могут давать истинные суспензии, осаждающиеся в соответствии с законом Стокса (в них частицы распределены в виде индивидуальных частиц), и “склеенные” суспензии, осаждающиеся много быстрее и содержащие комочки из нескольких частиц сорбента [10, стр.152-153]. Истинные суспензии осаждаются в виде плотного, труднодиспергируемого осадка. “Склеенные” суспензии осаждаются в виде рыхлого и легкодиспергируемого осадка. Предпочтение следует отдавать растворителям, дающим с данным сорбентом истинную суспензию. Мнения о концентрации суспензии, оптимальной для упаковки колонок расходятся: некоторые авторы получают наилучшие результаты с очень разбавленными суспензиями (1-5%), другие – с концентрацией (10-30%). Очевидно, для каждой системы растворитель-сорбент существует диапазон концентраций суспензии, дающий наилучшую упаковку слоя сорбента [10, стр.153]. Однако данный способ приготовления высокоэффективных колонок со сверхсшитыми полимерными сорбентами на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола в виде суспензии в полярных кислородсодержащих органических растворителях (например, в ацетоне или спиртах) имеет следующие недостатки: 1. Не удается получить равномерную и плотную структуру слоя сорбента в колонке из-за наличия на поверхности ССПС положительного или отрицательного электрических зарядов. Наличие отрицательного заряда на поверхности ССПС связано с присутствием карбоксильных сильнокислотных, слабокислотных и функциональных фенольных групп, а наличие положительного – присутствием катионов металлов в структуре этого полимера, таких как хлориды железа, олова, титана, алюминия, которые используются в качестве катализаторов реакции Фриделя-Крафтса – реакции сшивания цепей линейного полистирола метиленовыми группами, и гидролизуются в водных растворах. 2. Не удается получить равномерную и плотную структуру слоя сорбента в колонке из-за наличия на поверхности ПС-ДВБ и полидивинилбензольных сорбентов положительного заряда. Наличие положительного заряда связано с присутствием катионов металлов в структуре этих полимеров, таких как хлориды железа, олова, титана, алюминия, цинка и т.п., которые используются в качестве катализаторов реакции Фриделя-Крафтса и гидролизуются в водных растворах. 3. Наличие карбонильных, карбоксильных и др. групп на поверхности сверхсшитых полимерных сорбентов, а также содержание в структуре полимера катионов железа, олова, титана, алюминия, цинка приводит к сорбции органических веществ биомолекул плазмы крови, мономерной кремниевой кислоты и ее олигомеров при хроматографическом разделении. 4. Наличие карбонильных и карбоксильных групп на поверхности сверхсшитого полимерного сорбента на основе полидивинилбензола приводит к набуханию сорбента в колонке в течение 30-35 суток в подвижной фазе – абсолютированном этаноле, что приводит к резкому повышению давления на входе в колонку. 5. Из-за различной степени набухания сверхсшитых полимерных сорбентов в органических и водно-органических средах, в процессе разделения на колонках при использовании элюентов, содержащих 50-95% воды, образуются микропустоты в колонке, что приводит к снижению эффективности разделения. 6. Изменение положительного заряда на поверхности сверхсшитых полимерных сорбентов в водной среде при рН выше 2,5 связано с постепенным гидролизом катионов железа, олова, титана, алюминия, цинка, в результате чего образуются микропустоты в колонке, что приводит к проседанию сорбента в колонке и, соотвественно, снижению эффективности разделения. Задача решаемая данным изобретением – устранение набухания сорбентов в процессе приготовления колонок, предотвращение потери эффективности колонок в процессе эксплуатации путем устранения катионов металлов, карбонильных и карбоксильных групп с поверхности сверхсшитых полимерных сорбентов на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола и разрушение агломератов моносферических зерен сорбента. Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что предлагаемый способ приготовления высокоэффективных колонок с полимерными сорбентами для жидкостной хроматографии включает приготовление суспензии моносферических зерен сверхсшитого полимерного сорбента на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола диаметром 5 и 10 мкм в водном растворе щелочи с рН 11-14, выдерживание ее при комнатной температуре в течение 0,5-60 часов для удаления с поверхности сорбента катионов металлов, карбонильных и карбоксильных групп; введение этой суспензии в колонку, упаковку сорбента в колонке и его уплотнение при максимальном давлении (250-300 атм.) последовательным пропусканием водного раствора щелочи с рН 11-14, в котором не происходит набухание сорбента при комнатной температуре. Приготовленные хроматографические колонки (150 мм × 3 мм), заполненные моносферическими зернами сверхсшитого полимерного сорбента на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола диаметром 5 и 10 мкм имеют эффективность 30000-40000 т.т./м по гексану (при скорости элюента – 96%-го этанола – 0,1 мл/мин). Высокоэффективные эксклюзионно-хроматографические колонки характеризуются следующими параметрами: моносферические зерна сорбента имеют диаметр 10 мкм и менее [11, с.1, 113]; длина колонки при размере частиц сорбента 5-6 мкм составляет 10-15 см [11, с.200]; диаметр колонки 0,26-0,70 см [11, с.183]; противодавление колонки до 7000 psi (490 ат) [11, с.128, 141]; скорость потока элюента до 3 мл/мин [11, с.128]; объем проточной кюветы рефрактометра 5-10 мкл [11, с.151]; колонка с частицами сорбента 10 мкм дает эффективность 7000-10000 т.т. на 25 см длины. Пример 1. 1,5 см3 моносферических зерен диаметром 10 мкм сверхсшитого полистирольного сорбента (ССПС) марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 å, помещают в 10 см3 96%-го этанола при комнатной температуре. Через 1 час суспензию ССПС переносят на стеклянный фильтр с диаметром пор менее 10 мкм и отфильтровывают этанол под вакуумом. ССПС переносят на сито с размером ячейки 20 мкм и протирают его через сито с дробным добавлением (по 0,5-1,0 см3) 15 см3 96%-го этанола для разрушения агломератов моносферических зерен сорбента. Суспензию ССПС помещают в металлическое устройство для заполнения колонок объемом 15 см3, герметизируют его с помощью головки, к которой присоединяют в металлическом корпусе с помощью штуцера и фторопластовой прокладки стеклянную колонку длиной 150 мм, внутренним диаметром 3 мм (150 мм × 3 мм), на противоположном конце которой установлен металлический фильтр, фторопластовая прокладка и фитинг. Устройство для заполнения колонок с присоединенной колонкой переворачивают, и заполнение колонки ССПС осуществляют в положении снизу-вверх. При плавном повышении давления до 30 МПа продавливают суспензию ССПС через колонку, подавая в устройство для заполнения колонок насосом растворитель. Суспензию ССПС отфильтровывают на фильтре колонки, формируя упорядочный слой сорбента. При прокачивании через колонку 15 см3 этанола, останавливают поток растворителя, давление снижают до нуля и отсоединяют колонку. Удаляют избыток сорбента с конца колонки с помощью скальпеля, устанавливают металлический фильтр, фторопластовую прокладку и присоединяют второй фитинг. Заполненную ССПС колонку устанавливают на жидкостной хроматограф, прокачивают через нее до установления равновесия рабочий растворитель, после чего она готова к работе. Приготовленная такими действиями по известному способу [10] колонка имеет эффективность по гексану 4000 т.т./м (при скорости элюента – 96%-го этанола – 0,1 мл/мин). В дальнейшей работе при использовании элюента – воды с рН 1-13 происходит проседание слоя ССПС в колонке и, соответственно, снижение эффективности колонки. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ССПС полностью не разрушаются при протирании его через сито и при использовании элюента – воды с рН 1-13 происходит изменение заряда моносферических зерен ССПС и гидролиз хлоридов металлов (железа, олова, титана, алюминия, цинка и др.). При хроматографическом разделении на колонке с ССПС олигомеров этоксисилоксанов и кремниевой кислоты, имеющихся в гидролизате тетраэтоксисилана, (элюент – абсолютный этанол – 0,1 мл/мин), отмечается сорбция кремниевой кислоты на сорбенте. Использование органического растворителя – этанола для приготовления суспензии моносферических зерен сорбента ССПС при заполнении колонки при высоком давлении (30 МПа) по известному способу [10] не обеспечивает получение колонки с высокой эффективностью для ВЭЖХ. Пример 2. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами ССПС диаметром 10 мкм марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 å приготавливают аналогично примеру 1, с той разницей, что для приготовления суспензии моносферических зерен ССПС используют толуол, как в известном способе [10]. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 1500 т.т./м (при скорости элюента – 96%-го этанола – 0,1 мл/мин). В дальнейшей работе при использовании элюента – воды с рН 1-13 происходит проседание слоя ССПС в колонке. Использование органического растворителя как в известном способе [10] – толуола для приготовления суспензии моносферических зерен сорбента ССПС при заполнени колонки при высоком давлении (30 МПа) по известному способу [10] не обеспечивает получение колонки с высокой эффективностью для ВЭЖХ. Пример 3. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) приготавливают аналогично примеру 1 по известному способу [10], с той разницей, что для приготовления колонки используют моносферические зерна диаметром 10 мкм высокосшитого полидивинилбензольного сорбента с диаметром пор 500 å, которые выдерживают давление до 30 МПа. Заполнение колонки суспензией сорбента осуществляют при давлении 25 МПа. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 3500 т.т./м (при скорости элюента – 96%-го этанола – 0,1 мл/мин). В дальнейшей работе при использовании элюента – воды с рН 1-13 происходит проседание слоя сорбента в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен полидивинилбензольного сорбента полностью не разрушаются при протирании сорбента через сито и при использовании элюента – воды с рН 1-13 происходит изменение заряда моносферических зерен сорбента. Использование органического растворителя, как в известном способе [10] – этанола для приготовления суспензии моносферических зерен высокосшитого полидивинилбензольного сорбента при заполнении колонки при высоком давлении (25 МПа) не обеспечивает получение колонки с высокой эффективностью для ВЭЖХ. Пример 4. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами полимерного сорбента на основе полистирола-дивинилбензола (ПС-ДВБ) диаметром 10 мкм и диаметром пор 500 å приготавливают аналогично примеру 1, с той разницей, что для приготовления суспензии моносферических зерен ПС-ДВБ сорбента используют тетрагидрофуран, как в известном способе [10]. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 4500 т.т./м (при скорости элюента – 96%-го этанола – 0,1 мл/мин). В дальнейшей работе при использовании элюента – воды с рН 1-13 происходит проседание слоя ПС-ДВБ сорбента в колонке. Использование органического растворителя – тетрагидрофурана для приготовления суспензии моносферических зерен ПС-ДВБ сорбента при заполнени колонки при высоком давлении (30 МПа) по известному способу [10] не обеспечивает получение колонки с высокой эффективностью для ВЭЖХ. Пример 5. Готовят суспензию – 1,5 см3 моносферических зерен ССПС диаметром 10 мкм марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 å, в соответствии с предложенным изобретением, помещают в 10 см3 водного раствора щелочи (NaOH) с рН 13, и оставляют при комнатной температуре на 12 часов. Затем суспензию ССПС помещают в металлическое устройство для заполнения колонок объемом 15 см3, герметизируют его с помощью головки. К головке присоединяют в металлическом корпусе с помощью штуцера и фторопластовой прокладки стеклянную колонку (150 мм × 3 мм), на конце которой установлен металлический фильтр, фторопластовая прокладка и фитинг. Устройство для заполнения колонок с присоединенной колонкой переворачивают, и заполнение колонки суспензией ССПС осуществляют в положении снизу-вверх. При плавном повышении давления до 30 МПа продавливают суспензию ССПС через колонку, подавая в устройство для заполнения колонок насосом водный раствор щелочи с рН 13. Суспензию ССПС отфильтровывают на фильтре колонки, формируя упорядочный слой сорбента. После прокачивания через колонку 15 см3 водного раствора щелочи, останавливают поток растворителя, давление снижают до нуля и отсоединяют колонку. Удаляют избыток сорбента с конца колонки с помощью скальпеля, устанавливают металлический фильтр, фторопластовую прокладку и присоединяют второй фитинг. Заполненную ССПС колонку устанавливают на жидкостной хроматограф, прокачивают через нее дистилированную воду для удаления щелочи, а затем 96%-ный этанол до установления равновесия, после чего она готова к работе. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 30000 т.т./м (при скорости элюента – 96%-го этанола – 0,1 мл/мин). При использовании элюента – воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя ССПС марки Chromalite 10HMN2 в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ССПС при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента и хлориды металлов. На фиг.1 представлена хроматограмма олигомеров этоксисилоксанов в гидролизате тетраэтоксисилана, полученная на колонке (300 мм × 3 мм) (соединенные две стеклянные колонки 150 мм × 3 мм) с ССПС марки Chromalite 10HMN2. Олигомеры этоксисилоксанов: 1 – олигоэтоксисилоксан (Si13), 2-4 – олигоэтоксисилоксаны (Si2-Si6) и мономеры: 5 – тетраэтоксисилан, 6 – кремниевая кислота. Детектор – дифференциальный рефрактометр RIDK-102 юстирован по циклогексану, чувствительность 16×10-7 ед. рефракции; скорость сухого элюента – 0,2 мл/мин толуола, содержащего 1% изопропанола; температура термостата колонки, инжектора и детектора – 25°С; объем дозирующей петли – 10 мкл; проба 10 мкл 0,1% гидролизата тетраэтоксисилана в сухом толуоле, содержащего 1% изопропанола. При хроматографическом разделении на колонке с ССПС марки Chromalite 10HMN2 не отмечается сорбции кремниевой кислоты, содержащейся в гидролизате тетраэтоксисилана. Пример 6. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами ССПС диаметром 10 мкм марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 å приготавливают по предлагаемому изобретению аналогично примеру 5, с той разницей, что для приготовления суспензии моносферических зерен сорбента используют водный раствор щелочи (NaOH) с рН 14, а время обработки сорбента в щелочи составляет 30 минут. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 30000 т.т./м (при скорости элюента – 96%-го этанола – 0,1 мл/мин). При использовании элюента – воды с рН 1-14 не происходит проседание слоя ССПС марки Chromalite 10HMN2 в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ССПС при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента, и хлориды металлов в результате гидролиза. Пример 7. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами ССПС диаметром 10 мкм марки Chromalite 10HMN2 с диаметром пор 1000 å приготавливают аналогично примеру 5, с той разницей, что для приготовления суспензии моносферических зерен сорбента используют водный раствор щелочи (NaOH) с рН 11, а время обработки сорбента в щелочи составляет 60 часов. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 30000 т.т./м (при скорости элюента – 96%-го этанола – 0,1 мл/мин). При использовании элюента – воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя ССПС марки Chromalite 10HMN2 в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ССПС при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента, и хлориды металлов в результате гидролиза. Пример 8. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) приготавливают по предлагаемому изобретению аналогично примеру 5, с той разницей, что для приготовления колонки используют моносферические зерна диаметром 10 мкм высокосшитого полидивинилбензольного сорбента с диаметром пор 500 å и заполнение колонки суспензией сорбента осуществляют при давлении 25 МПа. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 30000 т.т./м (при скорости элюента – 96%-го этанола – 0,1 мл/мин). При использовании элюента – воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя полидивинилбензольного сорбента в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен сорбента при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента. На фиг.2-3 представлены хроматограммы, полученные на колонке с полидивинилбензольным сорбентом диаметром 10 мкм. Сигналы детектора через интерфейс записывают в компьютер с помощью программы “Экохром”. На фиг.2 представлена хроматограмма определения флуоресцирующих комплексов глутатиона и металлотионеина с N-(9-акридин)-малеимидом (NAM) в ацетонитрильном экстракте плазмы крови (10 мкл) крупного рогатого скота (коровы) из Тырнауза. 1, 2, 3, 6, 7, 8 – металлотионеины с NAM с временами удерживания 2,14, 2,31, 2,56, 5,22, 6,06, 8,02 мин; 4, 5 – металлотионеины + глутатион с NAM временами удерживания 3,32, 4,14 мин. При определении металлотионеина в плазме крови животных использовали методику [12] со следующими внесенными изменениями: – из плазмы крови металлотионеин экстрагировали ацетонитрилом, при этом высокомолекулярные белки высаждались; – после центрифугирования ацетонитрильный экстракт из плазмы крови подвергали дереватизации и проведению реакции с NAM по методике [12]; Детектор – флуоресцентный RF-530 (Шимадзу), возбуждение при 360 нм, флуоресценция при 435 нм; скорость элюента – 0,4 мл/мин 0,05 М фосфатного буфера с рН 6,5, содержащего 35% этанола; проба 10 мкл дериватизата из ацетонитрильного экстракта плазмы крови в 0,05 М фосфатном буфере с рН 6,5. Хроматографирование ацетонитрильных экстрактов металлотионеина из плазмы крови животных позволяет заметно повысить чувствительность анализа за счет увеличения объема исследуемой плазмы и сократить время анализа до 25 мин за счет уменьшения коэкстрактивных веществ, реагируемых с NAM. На фиг.3 представлена хроматограмма определения стандарта металлотионеина (100 нг) в виде флуоресцирующих комплексов с NAM по методике [12]. 1-9 – металлотионеины с NAM с временами удерживания 2,12, 2,31, 3,40, 4,33, 6,08, 6,47, 11,45, 14,45 и 15,58 мин. Детектор – флуоресцентный RF-530 (Шимадзу), возбуждение при 360 нм, флуоресценция при 435 нм; скорость элюента – 0,4 мл/мин 0,05 М фосфатного буфера с рН 6,5, содержащего 35% этанола. Пример 9. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) приготавливают по предлагаемому изобретению аналогично примеру 5, с той разницей, что для приготовления колонки используют моносферические зерна диаметром 5 мкм высокосшитого полидивинилбензола с диаметром пор 500 å и заполнение колонки суспензией сорбента осуществляют при давлении 25 МПа. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 40000 т.т./м (при скорости элюента – 96%-го этанола – 0,1 мл/мин). При использовании элюента – воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя полидивинилбензольного сорбента в колонке в связи с тем, что агломераты моносферических зерен сорбента при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента. На фиг.4 представлена хроматограмма, полученная на колонке с полидивинилбензольным сорбентом диаметром 5 мкм, олигомеров этоксисилоксанов в гидролизате тетраэтоксисилана. Олигомеры этоксисилоксанов: 1 – олигоэтоксисилоксан (Si13), 2-4 – олигоэтоксисилоксаны (Si2-Si6) и мономеры: 5 – тетраэтоксисилан и 6 – кремниевая кислота (Si(OH)4). Детектор – дифференциальный рефрактометр RIDK-102 юстирован по абсолютному этанолу, чувствительность 8×10-7 ед. рефракции; скорость элюента – абсолютного этанола – 0,18 мл/мин; температура термостата колонки, инжектора и детектора – 25°С; объем дозирующей петли – 10 мкл; проба 10 мкл 0,4% гидролизата тетраэтоксисилана в абсолютном этаноле. При хроматографическом разделении на колонке с полидивинилбензольным сорбентом не отмечается сорбции кремниевой кислоты на сорбенте, содержащейся в гидролизате тетраэтоксисилана. На фиг.5 представлена хроматограмма, полученная на колонке с полидивинилбензольным сорбентом диаметром 5 мкм, гидратированных форм сульфата натрия – 1-8 с временами удерживания 3,16, 3,32, 4,08, 4,26, 5,09, 6,33, 7,43, 8,46 мин. Детектор – УФ – 230 нм (спектрофотометр фирмы Хитачи 320 с кюветой объемом 7 мкл); скорость элюента – 0,2 мл/мин 80% ацетонитрила в воде; проба 10 мкл насыщенного водного раствора сульфата натрия. Пример 10. Стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами высокосшитого полидивинилбензольного сорбента диаметром 5 мкм с диаметром пор 500 å приготавливают по предлагаемому изобретению аналогично примеру 9, с той разницей, что для приготовления суспензии сорбента используют водный раствор щелочи (NaOH) с рН 11, а время обработки сорбента в щелочи составляет 60 часов. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 40000 т.т./м (при скорости элюента – 96%-го этанола – 0,1 мл/мин). При использовании элюента – воды с рН 1-13 не происходит проседание слоя полидивинилбензольного сорбента в колонке в связи с тем, что агломераты моносферических зерен сорбента при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента. Пример 11. По предлагаемому изобретению стеклянную колонку (150 мм × 3 мм) с моносферическими зернами полимерного сорбента на основе полистирола-дивинилбензола диаметром 10 мкм с диаметром пор 500 å приготавливают аналогично примеру 5. Приготовленная колонка имеет эффективность по гексану 35000 т.т./м (при скорости элюента – 96%-го этанола – 0,1 мл/мин). При использовании элюента – воды с рН 1-14 не происходит проседание слоя ПС-ДВБ сорбента в колонке. Это связано с тем, что агломераты моносферических зерен ПС-ДВБ сорбента при заполнении колонки разрушаются в водном растворе щелочи, так как удаляются карбонильные и карбоксильные группы с поверхности сорбента и хлориды металлов в результате гидролиза. Источники информации 1. А.С. СССР №948110, МКИ С 08 F 212/08; С 08 F 8/00. Способ получения макросетчатых изопористых полимеров стирола / М.П.Цюрупа, В.А.Даванков, Е.И.Люстгартен, А.Б.Пашков, Л.А.Бельчич. Опубл. 23.04.1983, Бюл. №15. 6. Пеннер Н.А. Сверхсшитые полистирольные сорбенты для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Дис. канд. хим. наук. М., 2000, 178 с. 9. Сычев К.С. Применение сверхсшитого полистирола в высокоэффективной жидкостной хроматографии и твердофазной экстракции. Дис. канд. хим. наук. М., 2004, 147 с. 10. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.Б. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. – М.: Химия, 1986, 271 с. 11. W.W.Yau, J.J.Kirkland, D.D.Bly. Modern Size-Exclusion liquid chromatograhy. Practice of Gel permleation and Gel Filtration Chromatograhy. New York-Chichester-Brisban-Toronto, 1979. P.393. Формула изобретения
1. Способ приготовления высокоэффективных колонок с полимерными сорбентами для жидкостной хроматографии, включающий приготовление суспензии моносферических зерен сверхсшитого полимерного сорбента на основе полистирола, полистирола-дивинилбензола и полидивинилбензола в растворе, введение суспензии в колонку, продавливание суспензии через колонку при повышении давления при подаче раствора, упаковку, уплотнение и формирование упорядочного слоя сорбента, прокачивание раствора через колонку и снижение давления, отличающийся тем, что в качестве раствора используют водный раствор щелочи с рН 11-14, причем перед введением суспензии в колонку сорбент выдерживают в упомянутом растворе в течение 0,5-60 часов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для приготовления суспензии используют зерна сорбента диаметром 5 и 10 мкм. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что уплотнение сорбента осуществляют при максимальном давлении 25-30 МПа.
РИСУНКИ
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 08.02.2007
Извещение опубликовано: 20.06.2008 БИ: 17/2008
|
||||||||||||||||||||||||||
) от рН, при рН<4,3 немодифицированный ССПС MN-200 имеет положительный заряд, достигающий максимального значения при рН 2,5-2,7, а при рН>4,3 имеет отрицательный заряд, достигающий максимального значения при рН 8-9.
-стирогеля (сополимер стирола и дивинилбензола) с малым размером пор (100 å и 500 å) наблюдается усадка слоя сорбента в колонке как в полярных, так и в неполярных растворителях. Удобным, хотя и весьма дорогим выходом из положения является использование отдельных наборов колонок для каждого применяемого растворителя. Некоторые фирмы с этой целью выпускают колонки с одним и тем же размером пор, заполненные разными растворителями – тетрагидрофураном, толуолом, хлороформом и диметилформамидом [10].
