Патент на изобретение №2276363
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВНУТРИУТРОБНОГО ИНФИЦИРОВАНИЯ ПЛОДА ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА-БАРР
(57) Реферат:
Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и перинатологии, и найдет применение как метод обследования беременных высокого перинатального риска в 2-3 триместрах гестации для прогнозирования степени риска развития внутритрубной инфекции у новорожденных. Способ осуществляют путем исследования аминиотической жидкости, заключающегося в том, что производят трансабдоминальный амниоцентез в сроки 16-40 недель беременности и в амниотической жидкости методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяют иммуноглобулин класса IgG к вирусу Эпштпейна-Барр и при оптической плотности исследуемого образца выше 1.4 Х ОПкрит, где ОПкрит = ОпсрК–+0,1, где ОпсрК– – средняя величина отрицательных контролей аминотических вод прогнозируют возможность развития у новорожденного вирусной инфекции Эпштейна-Барра. Преимущество изобретения заключается в упрощении способа прогнозирования.
(56) (продолжение): CLASS=”b560m”Cytomegalovirus and Epstein-Barr virus infections, N. Engl., Med, 1985, nov.14, 313(20), pp.1270-1274. COSTA S. et al., Detections of active Epstein-Barr infection in pregnan women, Eur. J. Clin. Microbiol, 1985, Jun., 4(30), pp.335-336.
Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и перинаталогии, и найдет применение как метод обследования беременных высокого перинатального риска в 2-3 триместрах гестации для прогнозирования степени риска развития внутриутробной инфекции у новорожденных. Выявление внутриутробно инфицированных плодов имеет особое значение еще и потому, что ВУИ протекает во время беременности без выраженной симптоматики, при этом либо отсутствуют клинические проявления у матери, либо они неспецифичны и инфекция протекает по типу “острого респираторного заболевания”. Окончательный диагноз внутриутробной инфекции в большинстве случаев ставится после рождения ребенка на основании лабораторных методов исследования. У некоторых новорожденных специфические симптомы инфекции отсутствуют. В этом случае особое значение приобретают методы дородовой диагностики, которые позволяют выявить внутриутробно инфицированный плод, уточнить этиологию инфекции у матери и провести необходимую терапию матери и ребенку до и сразу после рождения. По данным мировой литературы и опыту нашей страны достоверных методов дородовой диагностики ВУИ еще не найдено. Известен способ диагностики внутриутробного инфицирования плода генерализованной формы по патенту РФ №2205406 (2003.05.2). Способ включает исследование клеточного состава амниотической жидкости, отличающийся тем, что в амниотической жидкости определяется абсолютное содержание в десяти полях зрения макрофагов (М), лимфоцитов (Л), нейтрофильных сегментоядерных лейкоцитов (N) и эпителиальных клеток кожи плода (Э), рассчитывают показатель развития у плода генерализованной формы внутриутробного инфицирования по уравнению 1.007М. -0,723N. -0.826Л. +0.00Э и в случае, если полученный показатель ниже порогового значения, равного “-12,51”, диагностируют генерализованную форму внутриутробного инфицирования плода. Недостаток данного способа состоит в том, что он позволяет диагностировать только генерализованную форму ВУИ непосредственно после рождения ребенка. Известен способ диагностики внутриутробного инфицирования плода локальной формы по патенту РФ №2171990 (2001.08.10). У беременной извлекают амниотическую жидкость, в которой исследуют ее клеточный состав. В амниотической жидкости определяют абсолютное содержание в 10 полях зрения макрофагов (М), лимфоцитов (Л), нейтрофильных сегментоядерных лейкоцитов (N) и эпителиальных клеток кожи плода (Э), рассчитывают показатель развития локальной формы внутриутробного инфицирования плода по уравнению 1,329 М – 1,646 N – 0,229 Л+0,013 Э и в случае, если полученный показатель ниже порогового значения, равного “-13,05”, диагностируют локальную форму внутриутробного инфицирования плода. Недостаток данного способа состоит в том, что он позволяет диагностировать только локальную форму ВУИ непосредственно после рождения ребенка. Известен способ диагностики внутриутробного инфицирования плода во второй половине беременности по патенту РФ №2121687 (1998.11.10). Проводят однократное малоинвазивное исследование цервикальной слизи, в которой определяют уровень секреторного иммуноглобулина А и лизоцимную активность, и при значении суммы произведений этих параметров на коэффициенты соответственно – 0,11 и +8,6 и константы, равной – 1,86, превышающей 1,0, прогнозируют вероятное внутриутробное инфицирование плода, если же значение суммы меньше – 0,9, констатируют отсутствие вероятности возникновения этого осложнения, а при сумме меньше 1,0, но больше – 0,9 беременную относят к группе риска по внутриутробному инфицированию плода. Недостаток данного способа состоит в том, что неизвестен этиологический фактор, вызывающий инфицирование плода и соответственно не может быть назначена этиотропная терапия. Известен способ диагностики внутриутробного инфицирования плода по патенту РФ №2202790.(2003.04.20), который заключается в том, что при массовом скрининге альфа-фетопротеина, который проводится всем беременным, выделяют группу женщин с уровнем альфа-фетопротеина более 2 МоМ, при условии отсутствия пороков развития плода проводят определение специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови женщин к возбудителям внутриутробных инфекций: токсоплазме, цитомегаловирусам, хламидиям. При лабораторно доказанной острой инфекции у матери или обосрении хронической оценивали степень повреждения плаценты и плода с помощью ультразвукового исследования. Недостаток способа заключается в том, что не всегда инфицирование плодов происходит с увеличением уровня альфа-фетопротеина и наличие острого инфекционного процесса или реактивации можно диагностировать в течение двух недель с момента заражения. Известен способ прогнозирования степени риска развития внутриутробной инфекции у новорожденных по патенту РФ №2168946 (2001.06.20). Определяют воспалительные и дистрофические изменения последа, при этом определяют воспалительно-дистрофические изменения во всех частях последа: в различных участках плаценты, ворсинках и межворсинчатом пространстве, в оболочках последа, плаценте и ее сосудах; воспалительные и дистрофические изменения в плаценте определяют в центре на периферии, на материнской и плодовой поверхностях и по сочетанию выявленных воспалительно-дистрофических изменений в различных структурных частях последа прогнозируют степень риска развития внутриутробной инфекции у новорожденных. Недостаток данного способа: сложность и многофакторность исследования, а также то, что диагностика ВУИ возможна только после рождения ребенка. Известен способ диагностики внутриутробной инфекции плода по патенту РФ №2158927(2000.11.10). У беременных женщин извлекают амниотическую жидкость и приготовляют из нее для биохимического исследования препараты, в которых подсчитывают количество клеточных элементов макрофагов, лимфоцитов и сегментоядерных лейкоцитов в 10 полях зрения. При определенных показателях макрофагов, лимфоцитов, сегментоядерных лейкоцитов диагностируют внутриутробную инфекцию плода. Недостаток способа состоит в том, что он осуществляется в поздние сроки беременности (34-41 нед), что ухудшает прогноз для плода из-за возможного более длительного контакта с инфекционным агентом и отсроченной этиотропной терапии. Прототипом заявляемого изобретения выбран способ диагностики внутриутробной инфекции, описанный в работе Baschat A.A. и др. в журнале J. Matern Fetal Neonatal Med. 2003 Jun; 13. Сущность прототипа: у беременных женщин во втором триместре в амниотической жидкости определяют методом ПЦР ДНК вируса Эпштейн-Барр, ЦМВ и простого герпеса. К недостаткам прототипа следует отнести низкую эффективность способа. Следует отметить то, что определение риска развития внутриутробной инфекции в большинстве случаев осуществляют у женщин с предварительно выявленной серопозитивностью. В то же время вирусоносительство у матери далеко не всегда предполагает реализацию этой инфекции у плода. Однако ни один из этих способов не позволяет осуществить прогнозирование степени риска развития внутриутробного инфицирования плода конкретным этиологическим фактором. Задача изобретения – разработка способа прогнозирования внутриутробного инфицирования плода вирусом Эпштейна-Барр с 16 недель беременности. Поставленная задача решается тем, у беременных производят трансабдоминальный амниоцентез в сроки 16-40 недель беременности и в амниотической жидкости методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяют иммуноглобулин класса IgG к вирусу Эпштейна-Барр при длине волны 450 нм, и при выявлении иммуноглобулина класса IgG оптическая плотность исследуемого образца выше 1.4 Х ОПкрит, где ОПкрит = ОпсрК–+0,1, где ОпсрК– – средняя величина отрицательных контролей амниотических вод, прогнозируют возможность развития у новорожденного вирусной инфекции Эпштейна-Барра. Подробное описание метода Беременным в 16-40 недель гестации по медицинским показаниям осуществляют трансабдоминальный амниоцентез и производят аспирацию амниотической жидкости. В лабораторию ИФА поступало 5 мл околоплодных вод, которые центрифугировали 3 мин. При 5000 об/мин надосадочную жидкость отбирали в объеме 1 мл, в дальнейшем в этой жидкости определяли титр антител. Для определения иммуноглобулинов IgG к возбудителям вируса Эпштейна-Барр (EBV) использовалась надосадочная жидкость в разведении 1:100. Для выявления иммуноглобулинов класса IgG к вирусу Эпштейна-Барр использовалась тест-система “Вектор ВЭВ-NA-IgG-стрип”. Согласно методике исследуемую надосадочнаую жидкость разводят предварительно в 10 раз, 90 мкл раствора для разведения сывороток (РРС) вносят в микротитражные лунки вспомогательного планшета и добавляют по 10 мкл надосадочной жидкости, тщательно перемешивают. В лунки микропланшета с иммобилизированными ядерными антигенами вируса Эпштейна-Барр вносят по 90 мкл РРС и по 10 мкл предварительно разведенных исследуемых сывороток. Таким образом исследуемая сыворотка в лунке разбавляется в 100 раз. Одновременно в свободные лунки вносят по 100 мкл положительных контрольных образцов, содержащих определенное количество инактивированных IgG и по 100 мкл отрицательных контрольных образцов. Инкубируют планшет 30 мин при t=37°C во влажной камере. После пятикратной промывки лунок фосфатно-солевым буфером (ФСБ) лунки хорошо встряхивают и вносят 100 мкл раствора конъюгата (антитела к IgG человека, меченные пероксидазой хрена), инкубируют во влажной камере 30 мин при t=37°C. Промывают также, как описано выше, планшет встряхивают и вносят в лунки по 100 мкл тетраметилбензидин (ТМБ), инкубируют в темноте 25 мин, добавляют 50 мкл стоп-реагента (0,9 N H2SO4). Оптическую плотность цветной реакции регистрируют на фотометре (1420 MULTILABEL COUNTER, Финляндия) при длине волны 450 нм. Рассчитывают критическое значение оптической плотности исследуемого образца (ОПкрит) по формулам ОПкрит = ОпсрК–+0,1, где ОпсрК– – средняя оптическая плотность отрицательных контролей. Если значение оптической плотности исследуемого образца ОПисл Если ОПисл попадает в интервал 0,9 × ОПкрит – 1,4 × ОПкрит – результат сомнительный. Если ОПисл Пример 1 Больная С-ова Н. Н., 38 лет, история болезни №386. Наблюдалась в Ростовском НИИ акушерства и педиатрии с 6 недель беременности. В анамнезе: бесплодие первичное 9 лет, гипофункция яичников (ановуляция), дисбиоз, трихомониаз, олигозооспермия у супруга 2-3 степени. Беременность наступила на фоне индукции овуляции клостилбегитом после проведения ИИСМ. При динамическом акушерском наблюдении и в соответствии со стандартами обследования беременной было проведено полное клинико-лабораторное обследование. Выявлен гестационный пиелонефрит в стадии латентного течения. При уточнении инфекционного статуса диагностически значимых изменений не выявлено. При обследовании беременной в 16 недель гестации выявлены изменения в уровнях сывороточных белков крови, таких как хориогонический гонадотропин, прогестерон, альфа-фетопротеин и эстриол, которые были не характерны для хромосомных заболеваний и указывали на возможность развития фетоплацентарной недостаточности. При ультразвуковом исследовании – умеренно выраженное многоводие. С целью диагностики причины многоводия был произведен трансабдоминальный амниоцентез. Амниотическая жидкость методом ИФА исследовалась на наличие ВУИ. Оптическая плотность исследуемого образца амниотической жидкости была больше 1,4 Х ОПкрит, т. е. выявлена высокая вероятность инфицирования плода вирусом Эпштейна-Барр (положительный результат на наличие иммуноглобулинов класса IgG к вирусам Эпштейна-Барр). Это было рассчитано следующим образом: ОП образца пациента 0,450 Средняя ОП отрицательных контролей ОПсрК– = 0,178 ОПкрит = 0,278, т.к. ОПкрит = ОпсрК–+0,1 ОПкрит X 1,4=0,389 Результат считается положительным, если ОП образца пациента больше ОП Крит Х 1,4 (0,450>0,389). Проведено лечение с использованием противовирусных препаратов по одной из стандартных схем, разрешенных для применения во время беременности. Ребенок родился путем операции кесарево сечение в нижнем сегменте матки. Масса при рождении 3200 г, длина 49 см, оценка по шкале Апгар 7-9 баллов. При исследовании пуповинной крови новорожденного антитела к вирусу Эпштена-Барр не обнаружены. Пример 2 Больная П-ева Н. А., 30 лет, история болезни №502. Наблюдалась в Ростовском НИИ акушерства и педиатрии после программы ЭКО. В анамнезе бесплодие первичное в течение 11 лет. В первом триместре беременности при ультразвуковом исследовании выявлен участок отслойки хориона, в связи с чем проводилась сочетанная гормональная коррекция. При обследовании инфекционного статуса диагностически значимых изменений не выявлено. При обследовании беременной в 18 недель гестации обнаружены изменения в уровнях сывороточных белков крови (хориогонический гонадотропин, прогестерон, альфа-фетопротеин и эстриол), которые были не характерны для хромосомных заболеваний и указывали на возможность развития фетоплацентарной недостаточности. При ультразвуковом исследовании выявлено незначительное расширение желудочков мозга и умеренно выраженное многоводие. При допплерометрическом исследовании отмечалось нарушение маточно-плацентарной гемодинамики 1А степени. Был произведен трансабдоминальный амниоцентез. Оптическая плотность исследуемого образца амниотической жидкости равна 0,480 (больше 1,4 Х ОПкрит), т. е. выявлена вероятность инфицирования плода вирусом Эпштейна-Барр (в амниотической жидкости методом ИФА выявлен положительный результат на наличие иммуноглобулинов класса IgG к вирусам Эпштейна-Барр). Это было рассчитано следующим образом: ОП образца пациента 0,480 Средняя ОП отрицательных К – 0,186 ОПкрит = 0,286, т.к. ОПКрит = ОпсрК–+0,1 ОПкрит X 1,4=0,400 Результат считается положительным, если ОП образца пациента больше ОПкрит Х 1,4 (0,480>0,400). От проведения этиотропного лечения беременная отказалась. Проведена метаболическая терапия для улучшения фетоплацентарной гемодинамики. Роды в срок. Масса при рождении 2600 г, длина 46 см. Состояние при рождении средней тяжести, синдром задержки развития плода, внутриутробная инфекция вирусно-бактериальной этиологии, перинатальное гипоксически-ишемическая энцефалопатия, гипертензионный синдром. При инфекционном обследовании у ребенка в пуповинной крови новорожденного обнаружены иммуноглобулины класса М и G к вирусу Эпштейна-Барр. Пример 3 Больная Б – ян О. А., 29 лет, история болезни №695. Наблюдалась в Ростовском НИИ акушерства и педиатрии с 15 недель беременности. При обследовании инфекционного статуса диагностически значимых изменений не выявлено. В 16 недель беременности биохимические маркеры указывали на наличие фетоплацентарной недостаточности. В 22-23 недели беременности при ультразвуковом исследовании выявлено многоводие, преждевременное созревание плаценты и нарушение маточно-плацентарной гемодинамики при допплерометрическом исследовании. Был произведен трансабдоминальный амниоцентез. Оптическая плотность исследуемого образца амниотической жидкости равна 0,520 (больше 1,4 Х ОПкрит), т. е. выявлена высокая вероятность инфицирования плода вирусам Эпштейна-Барр (в амниотической жидкости выявлен положительный результат на наличие иммуноглобулинов класса IgG к вирусам Эпштейна-Барр). Это было рассчитано следующим образом: ОП образца пациента 0,520 ОпсрК– = 0,223 ОПкрит – 0,323, т.к. ОПкрит = ОпсрК–+0,1 ОПкрит Х 1,4=0,452 Результат считается положительным, если ОП образца пациента больше ОПкрит Х 1,4 (0,520>0,452). Проведено этиотропное лечение по одной из стандартных схем, разрешенных для применения во время беременности. Ребенок родился в срок. Масса при рождении 3400 г, длина 50 см. Оценка по шкале Апгар 8-9 баллов. При исследовании пуповинной крови новорожденного антитела к вирусу Эпштена-Барр не обнаружены. Таким образом, заявляемый способ позволяет выделить группу беременных, требующих дополнительного обследования, выявить инфекцию у матери, оценить состояние плода и провести при необходимости антенатальную терапию (этиопатогенетическую) задолго до рождения ребенка. Своевременно начатое лечение в антенатальном периоде позволит снизить заболеваемость и смертность новорожденных в неонатальном и младенческом периодах. Использование заявляемого способа прогнозирования внутриутробного инфицирования плода вирусом Эпштейна-Барр позволяет экономить затраты финансов и времени и своевременно профилактировать возможные осложнения. Данный способ прогнозирования внутриутробного инфицирования плода позволяет проводить дифференциальную диагностику между вирусоносительством матери и внутриутробным инфицированием плода и, таким образом, значительно снизить процент гипердиагностики данной патологии. Предлагаемый способ обладает очевидными преимуществами по сравнению с известными – позволяет выявить риск развития внутриутробной инфекции; – снижает гипердиагностику внутриутробной инфекции и соответственно медикаметозную нагрузку на организм матери и плода; – снижает затраты на необоснованное лечение; – может широко использоваться в специализированных акушерских стационарах; – может использоваться в амбулаторно-поликлинических отделениях. Способ позволяет выявить риск развития внутриутробной инфекции, уточнить этиологический фактор и степень влияния инфекции на плод, своевременно проводить обоснованное лечение, а также снизить затраты на реабилитацию новорожденных.
Формула изобретения
Способ прогнозирования внутриутробного инфицирования плода вирусом Эпштейна-Барр путем исследования амниотической жидкости, отличающийся тем, что у беременных производят трансабдоминальный амниоцнетез в сроки 16-40 недель беременности и в амниотической жидкости методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяют иммуноглобулин класса IgG к вирусу Эпштейна-Барр при длине волны 450 нм, и при выявлении в исследуемом образце иммуноглобулина класса IgG оптическая плотность которого выше 1.4 Х ОПкрит., где ОПкрит. = ОпсрК–+0,1, где ОпсрК– – средняя величина отрицательных контролей аминотических вод, прогнозируют возможность развития у новорожденного вирусной инфекции Эпштейна-Барра.
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 27.05.2007
Извещение опубликовано: 10.09.2008 БИ: 25/2008
|
||||||||||||||||||||||||||
0,9 × ОПкрит, то результат анализа считают отрицательным.
1,4 × ОПкрит – результат анализа положительный. Беременную в последних двух случаях относят к группе риска по внутриутробному инфицированию плода вирусом Эпштейна-Барр. Способ несложен в исполнении, имеет высокую диагностическую ценность и позволяет прогнозировать, диагностировать и проводить профилактику внутриутробного инфицирования плода вирусом Эпштейна-Барр.