Патент на изобретение №2273853

(54) СПОСОБ БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРОФЛОРЫ СОДЕРЖИМОГО ТОЛСТОЙ И ПРЯМОЙ КИШКИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к колопроктологии, гастроэнтерологии, клинической микробиологии. Способ включает отбор пробы, которую разводят дистиллированной водой, усредненные суспензии субстрата отстаивают, добавляют 95,5° этиловый спирт, центрифугируют в два этапа, из осадка делают монослойный мазок, который высушивают при комнатной температуре, фиксируют 95,5° этиловым спиртом, затем окрашивают мазок по Граму и определяют морфологию микроорганизмов. Изобретение обеспечивает быструю идентификацию большого числа видов микробных популяций при одновременном определении соотношений грамположительных и грамотрицательных форм.

Изобретение относится к области медицины, а именно к колопроктологии, гастроэнтерологии, клинической микробиологии и касается способа бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки.

Оценка состояния микробных популяций, заселяющих желудочно-кишечный тракт, является обязательной в комплексном обследовании больных с заболеваниями этого органа. Идентификация морфологии содержимого толстой и прямой кишки не возможна без получения в достаточном объеме качественных и количественных данных, с помощью которых можно определить в короткие сроки наличие микробных популяций без использования большого количества стандартных и сложных питательных сред и методов культивирования. При этом предпочтительны методики, обладающие высокой информативностью и низкой стоимостью, не дающие искажений в оценке количественных соотношений микробных популяций и морфологических типов.

Задачей изобретения является создание способа бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки.

Техническим результатом является достижение возможности получения в короткие сроки качественного и количественного учета возможно большего числа видов микробных популяций в месте их обитания – в толстой и прямой кишке при одновременном определении соотношений грамположительных и грамотрицательных форм, а также кокков и палочек, выявлении количества морфологически специфичных микроорганизмов: бифидобактерий, грибков и споровых форм.

Технический результат достигается тем, что предложен способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишок, включающий отбор пробы кала объемом 1 см³ из чашки Петри диаметром 60-90 мм из нескольких мест субстрата в количестве 10 порций погружением пробоотборников в субстрат на глубину 5 мм, затем отобранные порции субстрата с пробоотборниками размещают в стерильной пробирке и переводят их в стерильную дистиллированную воду разрушением и встряхиванием конгломератов субстрата, при этом соотношение воды и субстрата составляет 10:1, удаляют из пробирки пустые пробоотборники, а полученную суспензию субстрата отстаивают в пробирке в течение 14-16 мин, отбирают из пробирки стерильной пастеровской пипеткой 5 мл надосадочной жидкости, оставшуюся часть суспензии растирают в гомогенизаторе до полного растворения в дистиллированной воде пробы субстрата и возвращают в пробирку отобранные ранее из суспензии субстрата 5 мл порции надосадочной жидкости, полученную усредненную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивают в пробирке в течение 14-16 мин, отбирают стерильной пастеровской пипеткой в стерильную центрифужную пробирку 2 мл надосадочной жидкости, добавляют в нее 4 мл 95,5° этилового спирта с получением смеси спирта и надосадочной жидкости, которую центрифугируют в два этапа, сначала в течение 4-6 мин при скорости 1500 об/мин, затем в течение 9-11 мин при скорости 3000 об/мин., затем стерильной пастеровской пипеткой удаляют из смеси надосадочную жидкость и отбирают микропипеткой пробу осадка в количестве 0,02 мл, которую размещают в виде равномерного плоского монослойного мазка размером 2×2 см на стерильном предметном стекле распределением по нему пробы пластиковым шпателем, затем монослойный мазок субстрата на предметном стекле высушивают при комнатной температуре в течение 15-20 мин и фиксируют 95,5° этиловым спиртом в течение 8-12 мин, покрывая спиртом площадь мазка, а после испарения спирта осуществляют окрашивание мазка пробы по Граму стандартными красителями с соблюдением стандартной последовательности процедур окрашивания с последующим определением морфологии микроорганизмов, в том числе и морфологически-специфичных, определением их размеров, проведением подсчета микроорганизмов с их разделением на грамположительные и грамотрицательные формы, кокковые и палочковые, и определением их соотношений. При этом в качестве пробоотборника используют стерильные пластиковые наконечники микропипеток с внутренним диаметром 5 мм.

Способ осуществляется следующим образом. Из чашки Петри диаметром 60-90 мм с субстратом отбирают пробу кала объемом 1 см³ из нескольких мест субстрата в количестве 10 порций погружением пробоотборников в субстрат на глубину 5 мм, в качестве которых используют стерильные пластиковые наконечники микропипеток с внутренним диаметром 5 мм. Затем отобранные порции субстрата с пробоотборниками размещают в стерильной пробирке и переводят их в стерильную дистиллированную воду разрушением и встряхиванием конгломератов субстрата на шейкере марки «Stuart» в течение 3 мин, причем используют соотношение воды и субстрата 10:1. Пустые пробоотборники удаляют из пробирки. Полученную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивают в пробирке в течение 14-16 мин и отбирают из пробирки стерильной пастеровской пипеткой 5 мл надосадочной жидкости. Оставшуюся в пробирке часть суспензии растирают в гомогенизаторе до полного растворения в дистиллированной воде пробы субстрата и возвращают в пробирку отобранные ранее из суспензии субстрата 5 мл порции надосадочной жидкости. Затем полученную усредненную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивают в пробирке в течение 14-16 мин и отбирают стерильной пастеровской пипеткой в стерильную центрифужную пробирку 2 мл надосадочной жидкости, к которой добавляют 4 мл 95,5° этилового спирта с получением смеси спирта и надосадочной жидкости. Эту смесь центрифугируют в два этапа: сначала в течение 4-6 мин при скорости 1500 об/мин, затем в течение 9-11 мин при скорости 3000 об/мин. Затем стерильной пастеровской пипеткой удаляют из смеси надосадочную жидкость и отбирают микропипеткой пробу осадка в количестве 0,02 мл, которую размещают в виде равномерного плоского монослойного мазка размером 2×2 см на стерильном предметном стекле распределением по нему пробы пластиковым шпателем. Равномерный плоский монослойный мазок субстрата на предметном стекле высушивают при комнатной температуре в течение 15-20 мин и фиксируют 95,5° этиловым спиртом в течение 8-12 мин, покрывая спиртом площадь мазка. После испарения спирта осуществляют окрашивание мазка пробы по Граму стандартными красителями с соблюдением стандартной последовательности процедур окрашивания с последующим определением морфологии микроорганизмов, в том числе и морфологически-специфичных, определением их размеров, проведением подсчета микроорганизмов с их разделением на грамположительные и грамотрицательные формы, кокковые и палочковые, и определением их соотношений.

Проведенная сравнительная оценка полученных результатов при использовании предложенного способа бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишок, а также клинические испытания предложенного способа в ГНЦ колопроктологии показали его высокую эффективность. С использованием всех отличительных признаков предложенного технического решения достигнута возможность получения в короткие сроки (за 4-6 ч вместо 7 сут) качественного и количественного учета возможно большего числа видов микробных популяций в месте их обитания – в толстой и прямой кишке при одновременном их делении на грамположительные и грамотрицательные. Идентифицированы следующие формы бактерий: прямая, изогнутая, спиральная, коккобациллярная, ветвящаяся, плеоморфная, лентовидная и веретеновидная. Определено взаимное расположение отдельных бактерий: одиночные пары, короткие цепи (менее пяти бактерий), длинные цепи (более пяти бактерий), скопления, тетрады, комки и нити. При этом повышена избирательная способность, полнота морфологического учета и информативность способа в процессе обнаружения всего необходимого разнообразия микробных ассоциаций при минимальных искажениях в оценке их количественных соотношений. При этом одновременно получена возможность в течение 2-3 ч определить наличие бифидобактерий, а также наличие грибков в мазке в виде спор, мицелиальных форм и их количественной оценки.

Реализация предложенного способа бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишок иллюстрируется следующими клиническими примерами:

Пример 1. Больная Л., 46 лет, история болезни №3577-2003 г., поступила в ГУ ГНЦ колопроктологии с диагнозом: «Болезнь Крона толстой кишки». Состояние после лапароскопической илеостомии по Торнболлу по поводу перианальных осложнений для обследования и решения вопроса о дальнейшей тактике лечения.

Выполнен бактериоскопический экспрессный анализ по идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки.

Из чашки Петри диаметром 60 мм с субстратом отобрали пробу кала объемом 1 см³ из нескольких мест субстрата в количестве 10 порций погружением пробоотборников в субстрат на глубину 5 мм. При этом в качестве пробоотборников использовали стерильные пластиковые наконечники микропипеток с внутренним диаметром 5 мм. Затем отобранные порции субстрата с пробоотборниками разместили в стерильной пробирке и перевели их в стерильную дистиллированную воду разрушением и встряхиванием конгломератов субстрата на шейкере марки «Stuart» в течение 3 мин, причем использовали соотношение воды и субстрата 10:1. Пустые пробоотборники удалили из пробирки. Полученную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивали в пробирке в течение 16 мин и отобрали из пробирки стерильной пастеровской пипеткой 5 мл надосадочной жидкости. Оставшуюся в пробирке часть суспензии растерли в стеклянном гомогенизаторе Поттера со стеклянным пестиком до полного растворения в дистиллированной воде пробы субстрата и возвратили в пробирку отобранные ранее из суспензии субстрата 5 мл порции надосадочной жидкости. Затем полученную усредненную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивали в пробирке в течение 14 мин и отобрали стерильной пастеровской пипеткой в стерильную центрифужную пробирку 2 мл надосадочной жидкости, к которой добавили 4 мл 95,5° этилового спирта с получением смеси спирта и надосадочной жидкости. Эту смесь центрифугировали в два этапа: сначала в течение 6 мин при скорости 1500 об/мин, затем в течение 9 мин при скорости 3000 об/мин. Затем стерильной пастеровской пипеткой удалили из смеси надосадочную жидкость и отобрали микропипеткой пробу осадка в количестве 0,02 мл, которую разместили в виде равномерного плоского монослойного мазка размером 2×2 см на стерильном предметном стекле распределением по нему пробы пластиковым шпателем. Равномерный плоский монослойный мазок субстрата на предметном стекле высушили при комнатной температуре в течение 20 мин и зафиксировали 95,5° этиловым спиртом в течение 8 мин, покрывая спиртом площадь мазка. После испарения спирта осуществили окрашивание мазка пробы по Граму стандартными красителями с соблюдением стандартной последовательности процедур окрашивания с последующим определением морфологии микроорганизмов, в том числе и морфологическиспецифичных, определением их размеров, проведением подсчета микроорганизмов с их разделением на грамположительные и грамотрицательные формы, кокковые и палочковые, и определением их соотношений.

Через 5 ч после начала анализа (в день анализа) исследуемой пробы кала установлено следующее: общее микробное число – 5,0·10¹⁰ /мл, бифидобактерии – 10³, грибки – 10⁶, споровые бактерии – 10⁶, соотношение кокковых и палочковых форм составляет 58% к 42%, соотношение грамотрицательных и грамположительных составляет 83% к 17%. Разнообразие морфотипов составляет 11.

Пример 2. Больная М., 65 лет, история болезни №1017-2004 г., находилась на лечении в ГУ ГНЦ колопроктологии с диагнозом:

«Неспецифический язвенный колит». Больная обследована. При колоноскопии выявили хроническое воспалительное пролиферативное заболевание прямой кишки с признаками малигнизации.

Выполнен бактериоскопический экспрессный анализ по идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки.

Из чашки Петри диаметром 90 мм с субстратом отобрали пробу кала объемом 1 см³ из нескольких мест субстрата в количестве 10 порций погружением пробоотборников в субстрат на глубину 5 мм. При этом в качестве пробоотборников использовали стерильные пластиковые наконечники микропипеток с внутренним диаметром 5 мм. Затем отобранные порции субстрата с пробоотборниками разместили в стерильной пробирке и перевели их в стерильную дистиллированную воду разрушением и встряхиванием конгломератов субстрата на шейкере марки «Stuart» в течение 3 мин, причем использовали соотношение воды и субстрата 10:1. Пустые пробоотборники удалили из пробирки. Полученную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивали в пробирке в течение 14 мин и отобрали из пробирки стерильной пастеровской пипеткой 5 мл надосадочной жидкости. Оставшуюся в пробирке часть суспензии растерли в стеклянном гомогенизаторе Поттера со стеклянным пестиком до полного растворения в дистиллированной воде пробы субстрата и возвратили в пробирку отобранные ранее из суспензии субстрата 5 мл порции надосадочной жидкости. Затем полученную усредненную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивали в пробирке в течение 16 мин и отобрали стерильной пастеровской пипеткой в стерильную центрифужную пробирку 2 мл надосадочной жидкости, к которой добавили 4 мл 95,5° этилового спирта с получением смеси спирта и надосадочной жидкости. Эту смесь центрифугировали в два этапа: сначала в течение 4 мин при скорости 1500 об/мин, затем в течение 11 мин при скорости 3000 об/мин. Затем стерильной пастеровской пипеткой удалили из смеси надосадочную жидкость и отобрали микропипеткой пробу осадка в количестве 0,02 мл, которую разместили в виде равномерного плоского монослойного мазка размером 2×2 см на стерильном предметном стекле распределением по нему пробы пластиковым шпателем. Равномерный плоский монослойный мазок субстрата на предметном стекле высушили при комнатной температуре в течение 15 мин и зафиксировали 95,5° этиловым спиртом в течение 12 мин, покрывая спиртом площадь мазка. После испарения спирта осуществили окрашивание мазка пробы по Граму стандартными красителями с соблюдением стандартной последовательности процедур окрашивания с последующим определением морфологии микроорганизмов, в том числе и морфологически специфичных, определением их размеров, проведением подсчета микроорганизмов с их разделением на грамположительные и грамотрицательные формы, кокковые и палочковые, и определением их соотношений.

Через 6 ч после начала анализа исследуемой пробы кала установлено следующее: общее микробное число – 8,0·10¹⁰ /мл, бифидобактерии – 10², грибки – 10⁷, споровые бактерии – 10⁶, соотношение кокковых и палочковых форм составляет 73% к 27%, соотношение грамотрицательных и грамположительных составляет 78% к 22%. Разнообразие морфотипов составляет 13.

Таким образом, использование предложенного способа бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишок позволяет провести качественную и количественную идентификацию максимального числа видов микробных популяций в месте их обитания – в толстой и прямой кишке при одновременном их делении на грамположительные и грамотрицательные, при этом повышена избирательная способность, полнота морфологического учета и информативность способа в процессе обнаружения всего необходимого разнообразия микробных ассоциаций при минимальных искажениях в оценке их количественных соотношений. При этом получена возможность в течение 2-3 ч определить наличие бифидобактерий, а также наличие грибков в мазке в виде спор, мицелиальных форм и их количественной оценки.

Формула изобретения

Способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки, включающий отбор пробы кала, разбавление ее жидкостью в соотношении 1:10 для получения суспензии, встряхивание, центрифугирование, отделение осадка, содержащего микроорганизмы, и дальнейшее исследование, отличающийся тем, что пробы отбирают пробоотборниками в количестве 10 порций, помещают вместе с пробоотборниками в пробирки, добавляют стерильную дистиллированную воду, далее пробоотборники удаляют, полученную суспензию отстаивают в пробирке 14-16 мин, отбирают 5 мл надосадочной жидкости, оставшуюся часть суспензии растирают в гомогенизаторе до полного растворения, смешивают с ранее отобранными 5 мл, отстаивают 14-16 мин, затем отбирают в центрифужную пробирку 2 мл надосадочной жидкости, добавляют 4 мл 95,5° этилового спирта, полученную смесь центрифугируют в 2 этапа, сначала 4-6 мин при скорости 1500 об/мин, затем 9-11 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость удаляют, отбирают 0,02 мл осадка, далее готовят мазок на предметном стекле, высушивают при комнатной температуре 15-20 мин, фиксируют 95,5° этиловым спиртом 8-12 мин, затем окрашивают мазок по Граму, определяют морфологию микроорганизмов, подсчитывают и определяют их соотношение.