Патент на изобретение №2273840

(54) СПОСОБ НЕПРЕРЫВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК В СУСПЕНЗИЯХ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к оптическим анализаторам, в частности к лазерным анализаторам частиц, и может быть использовано для непрерывного измерения в реальном масштабе времени концентрации микробных клеток (плотности биомассы) в жидкостных ферментерах или аналогичных резервуарах с суспензиями клеток. Сущность изобретения заключается в непрерывном определении количества клеток в суспензиях по измерению интенсивности рассеянного ими света. Определение основано на использовании калибровочных данных, полученных при измерениях светорассеяния в суспензиях с известной концентрацией клеток того же типа, которые будут в анализируемых пробах. Интенсивность рассеянного света измеряется фотодетекторами, установленными под разными углами по отношению к освещающему лучу так, что диапазон детектирования составляет 0-180°. Из суспензии перед подачей в измерительную кювету предварительно удаляются пузырьки газа. Техническим результатом является достоверное определение концентрации микробных клеток в диапазоне 0,01-100 г/л в суспензиях, в том числе пробах из ферментера. 2 с.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл.

Изобретение относится к оптическим анализаторам, в частности к лазерным анализаторам частиц, и может быть использовано для непрерывного измерения в реальном масштабе времени концентрации микробных клеток (плотности биомассы) в жидкостных ферментерах или аналогичных резервуарах с суспензиями клеток.

При проведении процессов выращивания и биосинтеза клеток в ферментерах необходимо знать концентрацию клеток – плотность биомассы. Для этого традиционно используется весовой метод. Недостатками этого метода являются длительность анализа и разрушение пробы. Для автоматизированного контроля ферментаций необходим способ непрерывной регистрации биомассы неразрушающим способом в реальном масштабе времени. Наиболее известными аналогами, отвечающими этим требованиям, являются изобретения:

1. “Apparatus and method for optical density measurements of biomass processes» №4893935 USA, Jan.16, 1990 (Аппаратура и метод для измерений оптической плотности в процессах /выращивания/ биомассы.);

2. “Device and method for determining characteristic of a biomass” №6596507 B2 USA, Jul.22, 2003. (Прибор и метод для определения характеристик биомассы.)

Для определения плотности биомассы в патенте USA №4893935 применен способ определения биомассы путем измерения оптической плотности. В ферментер установлен датчик оптической плотности. Датчик содержит источник света и приемный фотодетектор. Свет от источника освещает исследуемую суспензию и непрерывно регистрируется фотодетектором. Сигнал фотодетектора зависит от концентрации клеток. Недостатком такого способа и устройства является ограниченный диапазон определения концентрации клеток в области высоких значений – не более 1 г/л, поскольку выше этой концентрации пропускание света близко к нулю.

Для определения плотности биомассы в патенте USA №6596507 В2 применен кондуктометрический способ. Диапазон определения концентрации клеток кондуктометром значительно больше, чем у датчика оптической плотности. Однако существенным недостатком этого способа и устройства является зависимость получаемых данных от проводимости среды, которая может сильно меняться в процессе ферментации.

Помимо вышеописанных, существуют способы и устройства определения концентрации техногенных микрочастиц, основанные на измерении интенсивности рассеянного микрочастицами света. В наиболее общем виде интенсивность светорассеяния зависит от размера и количества частиц, а также от характеристик источника света. Преимуществом приборов светорассеяния по сравнению с датчиком оптической плотности является больший диапазон и большая точность определения, а по сравнению с кондуктометрами – независимость показаний от проводимости среды.

Наиболее близким аналогом и выбранным за прототип являются способ и устройство, описанные в патенте USA №5416580, May 16, 1995, “Method and apparatus for determining small particle size distribution utilizing multiple light beams”. (Метод и аппаратура для определения распределения малых частиц по размерам с использованием множества световых лучей.)

Для определения размеров микрочастиц пропускают суспензию микрочастиц через измерительную кювету, освещают кювету несколькими лучами света, измеряют интенсивности рассеянного света фотодетектором в разных углах и рассчитывают распределение микрочастиц по размерам по специальному алгоритму.

Устройство состоит из гидравлической магистрали и насоса, проточной измерительной кюветы, источника света и фотодетектора, аналого-цифрового преобразователя и электронно-вычислительного блока. Благодаря возможности перемещать источник света можно менять угол детектирования рассеянного света. Устройство позволяет непрерывно определять функцию распределения по размерам микрочастиц суспензий, в том числе микробных клеток. Способ и устройство, его реализующее, имеют два ограничения для анализа суспензий микробных клеток в ферментере:

– анализируемая суспензия микрочастиц (микробных клеток) должна быть разбавленной до такой степени, чтобы выполнялось условие однократности светорассеяния. При нарушении условия однократности светорассеяния (многократное рассеяние в концентрированных мутных суспензиях) описанный расчет окажется неверным.

– наличие пузырей газа (воздуха) из ферментера может привести к значительным искажениям результатов анализа.

Задача, которая решается в предлагаемом изобретении, – это достоверное определение концентрации микробных клеток в диапазоне 0.01-100 г/л в суспензиях, в том числе пробах из ферментера.

Поставленная задача достигается тем, что в:

1. Способе непрерывного определения концентрации микробных клеток в суспензиях, включающем подачу суспензий через проточную измерительную кювету, освещение измерительной кюветы лазерным лучом и непрерывное детектирование интенсивности рассеянного света в диапазоне углов от 0 до 180 градусов, из суспензии микробных клеток перед каждой подачей в измерительную кювету удаляют пузыри газа; подают в измерительную кювету суспензию с известной концентрацией микробных клеток и осуществляют калибровку, включающую измерение интенсивности рассеянного микробными клетками света в разных углах по отношению к освещающему кювету лучу, установление зависимостей интенсивности светорассеяния от концентрации клеток для каждого выбранного угла измерений и определение границ диапазона, в котором интенсивность светорассеяния возрастает от нуля до максимума с возрастанием концентрации клеток; в области найденных границ методом наименьших квадратов определяют полиноминальные степенные функции, наиболее достоверно аппроксимирующие экспериментальные зависимости интенсивности светорассеяния от концентрации клеток для каждого выбранного угла измерений; сохраняют найденные степенные функции, как калибровочные уравнения для каждого выбранного угла измерений; подают в измерительную кювету анализируемую суспензию и осуществляют определение концентрации микробных клеток анализируемой суспензии путем измерения интенсивности рассеянного микробными клетками света в тех же углах, что и при калибровке суспензии с известной концентрацией на основании найденных калибровочных уравнений и границ диапазона.

2. Устройстве непрерывного определения концентрации микробных клеток в суспензиях, включающем гидравлическую магистраль, содержащую проточную измерительную кювету, насос, трубки и измерительное устройство, содержащее источник света и фотодетекторы, расположенные под разными углами в диапазоне от 0 до 180 градусов, аналого-цифровой преобразователь, электронно-вычислительный блок, в гидравлическую магистраль дополнительно введена газоотделительная система, включающая в себя газоотделительный резервуар, содержащий выходные отверстия, обеспечивающие соединения с трубой отбора суспензии, трубой подачи суспензии в измерительную кювету и газоотводной трубой, а также датчик нижнего уровня, установленный ниже газоотводного отверстия, датчик верхнего уровня, установленный выше датчика нижнего уровня, и контроллер, соединенный с одной стороны с датчиками нижнего и верхнего уровня, а с другой стороны с насосом; электронно-вычислительный блок выполнен таким образом, что обеспечивает преобразование данных интенсивности светорассеяния в значение концентрации микробных клеток.

Сущность изобретения заключается в непрерывном определении количества клеток в суспензиях по измерению интенсивности рассеянного ими света. Определение основано на использовании калибровочных данных, полученных при измерениях светорассеяния в суспензиях с известной концентрацией клеток. Для калибровки используются клетки того же типа, которые будут в анализируемых пробах. Интенсивность рассеянного света измеряется фотодетекторами, установленными под разными углами по отношению к освещающему лучу, так что диапазон углов детектирования составляет 0-180 градусов. Это позволяет определять как низкие концентрации клеток при однократном светорассеянии, так и высокие при многократном светорассеянии. Для улучшения точности и достоверности анализа из суспензии перед подачей в измерительную кювету предварительно удаляются пузыри газа.

Перечень всех фигур:

– фиг.1. Схема устройства;

– фиг.2. Схема газоотделительной системы;

– фиг.3. Блок-схема калибровки;

– фиг.4. Пример определения экспериментального массива I_j,I при прокачивании через устройство суспензий с клетками дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

– фиг.5. Пример расчета калибровочных зависимостей;

– фиг.6. Блок-схема измерения.

Устройство непрерывного определения концентрации микробных клеток в суспензиях по фиг.1 состоит из гидравлической магистрали, содержащей жидкостную трубу 1, газовую трубу 2, газоотделительную систему 3, проточную измерительную кювету 4, насос 5, и измерительного устройства, содержащего источник света 6, фотодетекторы 7, аналого-цифровой преобразователь 8 и электронно-вычислительный блок 9.

Газоотделительная система по фиг.2 состоит из газоотделительного резервуара 10, в котором установлены датчик нижнего уровня 11 и датчик верхнего уровня 12, электронного контролера скорости прокачки насоса 13.

Сущность работы устройства (фиг.1) заключается в следующем.

Подсоединяют трубы 1 гидравлической магистрали к резервуару с суспензией (например, ферментеру) и включают насос 5. Под действием давления насоса суспензия вытекает из ферментера по трубе 1, втекает в газоотделительную систему 3, в которой газовые пузыри удаляются из суспензии по трубе 2. Суспензия из газоотделительной системы втекает в измерительную кювету 4 и после прохождения через кювету соединяется с газовой фазой из трубы 2 и возвращается обратно в ферментер. Лазерный луч от источника света 6 освещает прозрачную измерительную кювету. Рассеянный клетками суспензии свет регистрируется фотодетекторами 7, расположенными в разных углах в диапазоне 0-180 градусов. Электрические аналоговые сигналы с фотодетекторов поступают в блок аналого-цифрового преобразования 8 и далее цифровые сигналы подаются в электронно-вычислительный блок 9, где происходит математическая обработка.

Сущность работы газоотделительной системы поясняется на фиг.2. Датчик нижнего уровня установлен ниже газоотводного отверстия трубы 2, датчик верхнего уровня установлен выше датчика нижнего уровня. Электрические сигналы с датчиков поступают на электронный контроллер скорости прокачки 13. Электрический выход контроллера соединен с насосом 5. Контроллер автоматически устанавливает скорость прокачки насоса 5 так, чтобы уровень заполнения резервуара 10 находился выше датчика 11 и ниже датчика 12. В газоотделительном резервуаре 10 пузыри газов поднимаются вверх, отделяются из жидкости и далее отводятся по трубе 2, минуя проточную кювету 4. Затем в точке соединения труб 1 и 2 происходит соединение газового потока из резервуара 3 и жидкостного из кюветы 4. После соединения потоков восстановленная суспензия возвращается в ферментер. Гидравлическая магистраль с ферментером составляют замкнутый контур. Такая конструкция магистрали позволяет производить отбор из ферментера и обратный возврат без контакта суспензии с окружающим воздухом и без нарушения ее состава. Таким образом, способ применим для непрерывного контроля уровня биомассы при проведении стерильных ферментаций.

Сущность работы измерительной системы заключается в следующем (см.фиг.1). Луч от источника 6 попадает на фотодетекторы 7, в которых осуществляется преобразование интенсивности света в пропорциональный по величине электрический сигнал. Аналоговые выходы от каждого фотодетектора поступают на вход аналого-цифрового преобразователя 8, преобразуются в цифровой сигнал и далее поступают на вход электронно-вычислительного блока 9. Электронно-вычислительный блок 9 осуществляет математические преобразования цифровых сигналов по специальному алгоритму, приведенному ниже.

Последовательность действий при калибровке следующая (см.Фиг.3):

1. Определяют рабочие диапазоны измерительных каналов.

Соединяют гидравлическую магистраль устройства и резервуар с суспензией. В резервуаре создают суспензии микробных клеток с различными концентрациями С_i от 0 до 100 г/л. Клетки берут того же типа, какой будет анализироваться, поскольку под каждый тип клеток должна быть индивидуальная калибровка. Закачивают суспензию из резервуара и подают на измерительную кювету луч от источника света. Для каждой суспензии, прокачиваемой через кювету, регистрируют показания фотодетекторов I_j,i, где j – номер фотодетектора, i – номер суспензии (см. пример в табл.1а). Определяют максимумы показаний каждого фотодетектора (I_j ^max) (см.фиг.4) и находят соответствующие им значения концентрации (C_j ^max). Рабочим диапазоном для j-го угла (C_j) является C_j-1 ^max-C_j ^max. Для j=1 рабочий диапазон будет С₁-С₁ ^max (см. пример в табл.1б).

График представленного массива показан на Фиг.4.

Табл.1б Определение рабочего диапазона
j	Угол регистрации, град	Ij max	Сj max	Сj
1	8	263	0.5	0.01-0.5
2	30	134	2	0.5-2
3	150	301	100	2-100

1. Находят уравнения зависимостей показаний каждого фотодетектора от концентрации клеток.

Для каждого j методом аппроксимации находят уравнение С=f(I, j), наиболее точно подходящее для описания экспериментальных значений I_i=F(C_i) на участке от C₁-C_j ^max (см. пример в табл.1в).

Графические зависимости найденных аппроксимирующих уравнений для 3 фотодетекторов показаны на Фиг.5.

Последовательность действий при определении концентрации микробных клеток следующая (см.фиг.6):

Соединяют гидравлическую магистраль устройства и резервуар с анализируемой суспензией. Закачивают суспензию из резервуара и подают на измерительную кювету луч от источника света. Регистрируют показания фотодетекторов I_j. Подставляют в калибровочные уравнения С=f(I, j) значения I_j и j и находят вектор C_j. Находят в векторе С_j элементы, значения которых находятся в интервале С_j, и из них находят элемент с наибольшим j. Найденное значение является искомой концентрацией клеток. В таблице 2 приведены примеры экспериментов.

Табл.2
j		Ij		Cj	Cj	Определяемая концентрация клеток, г/л
Эксперимент 1
1		66		0.024	0.01-0.45	0.024
2		23		0.020	0.45-1.8
3		35		-1.011	1.8-90
Эксперимент 2
1		180		0.215	0.01-0.45	0.509
2		110		0.509	0.45-1.8
3		40		0.608	1.8-90
Эксперимент 3
1		61.36		0.019	0.01-0.45	2.680
2		116.6		0.607	0.45-1.8
3		47.11		2.680	1.8-90
Эксперимент 4
1	14.28		-0.008		0.01-0.45	10.657
2	39.31		0.175		0.45-1.8
3	90.38		10.657		1.8-90
Эксперимент 5
1	3.269		-0.010		0.01-0.45	65.633
2	6.107		-0.289		0.45-1.8
3	290		65.633		1.8-90

Таким образом, заявляемые способ и устройство, его реализующее, позволяют по сравнению с прототипом определять концентрацию микробных клеток в диапазоне 0.01-100 г/л в суспензиях и могут быть использованы в оперативном контроле роста микробных клеток в биотехнологических процессах.

Формула изобретения

1. Способ непрерывного определения концентрации микробных клеток в суспензиях, включающий подачу суспензий через проточную измерительную кювету, освещение измерительной кюветы лазерным лучом и непрерывное детектирование интенсивности рассеянного света в диапазоне углов от 0 до 180°, отличающийся тем, что из суспензии микробных клеток перед каждой подачей в измерительную кювету удаляют пузыри газа; подают в измерительную кювету суспензию с известной концентрацией микробных клеток и осуществляют калибровку, включающую измерение интенсивности рассеянного микробными клетками света в разных углах по отношению к освещающему кювету лучу, установление зависимостей интенсивности светорассеяния от концентрации клеток для каждого выбранного угла измерений и определение границ диапазона, в котором интенсивность светорассеяния возрастает от нуля до максимума с возрастанием концентрации клеток; в области найденных границ методом наименьших квадратов определяют полиноминальные степенные функции, наиболее достоверно аппроксимирующие экспериментальные зависимости интенсивности светорассеяния от концентрации клеток для каждого выбранного угла измерений; сохраняют найденные степенные функции как калибровочные уравнения для каждого выбранного угла измерений; подают в измерительную кювету анализируемую суспензию и осуществляют определение концентрации микробных клеток анализируемой суспензии путем измерения интенсивности рассеянного микробными клетками света в тех же углах, что и при калибровке суспензии с известной концентрацией, на основании найденных калибровочных уравнений и границ диапазона.

2. Устройство непрерывного определения концентрации микробных клеток в суспензиях, включающее гидравлическую магистраль, содержащую проточную измерительную кювету, насос, трубки и измерительное устройство, содержащее источник света и фотодетекторы, расположенные под разными углами в диапазоне от 0 до 180°, аналогово-цифровой преобразователь, электронно-вычислительный блок, отличающееся тем, что в гидравлическую магистраль дополнительно введена газоотделительная система, включающая в себя газоотделительный резервуар, содержащий выходные отверстия, обеспечивающие соединения с трубой отбора суспензии, трубой подачи суспензии в измерительную кювету и газоотводной трубой, а также датчик нижнего уровня, установленный ниже газоотводного отверстия, датчик верхнего уровня, установленный выше датчика нижнего уровня, и контроллер, соединенный с одной стороны с датчиками нижнего и верхнего уровней, а с другой стороны с насосом; электронно-вычислительный блок выполнен таким образом, что обеспечивает преобразование данных интенсивности светорассеяния в значение концентрации микробных клеток.

РИСУНКИ