Патент на изобретение №2273026

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРПАРАПРОТЕИНЕМИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Способ диагностики гиперпарапротеинемии заключается в том, что сыворотку крови исследуют методом клиновидной дегидратации, при этом каплю сыворотки предварительно высушивают на предметном стекле и затем анализируют структуру полученной фации под микроскопом. При наличии в центральной и/или промежуточной зонах фации аномальных сетчатых радиальных структур диагностируют среднюю степень выраженности парапротеинемии. При наличии отдельнолежащих «глыбок» и/или «глыбок», расположенных по краям трещин в центральной зоне фации, диагностируют высокую степень выраженности парапротеинемии. Способ доступен, прост в исполнении, позволяет выявить гиперпарапротеинемию в короткие сроки. 1 табл., 3 ил.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”ШАБАЛИН В.Н. и др. Морфология биологических жидкостей человека. М.: Хризостом, 2001, с. 113-128.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может использоваться для диагностики гиперпарапротеинемии и степени ее выраженности у больных с подозрением на множественную миелому.

Парапротеин, “миеломные” белки, М-градиент – структурно-аномальные, функционально-инертные белки, не существующие в плазме в норме. Появление в плазме аномальных белков, отсутствующих в нормальных условиях, называют парапротеинемией. М-градиент (парапротеины) выявляются при плазмацитоме (миеломе) и макроглобулинемии Вальденстрема, лимфоретикулярных неоплазиях и при некоторых злокачественных эпителиальных опухолях. Кроме того, в незначительных количествах эти белки обнаружваются у здоровых людей. Появление М-градиента обусловлено выработкой моноклональных белков клетками злокачественной плазмоцитомы и атипичными лимфоцитарными клетками при макроглобулинемии Вальденстрема. Все молекулы этого белка обладают одинаковыми характеристиками (заряд, размер, конфигурация) и на электрофореграмме проявляются в виде узкой четкой полосы белка-маркера, который на денситограмме представлен пиком с узким основанием. В 90% случаев М-градиент обнаруживается в зоне -глобулинов, в 6-7% в области -глобулинов и крайне редко – в 2-фракции глобулинов [4, 5].

Парапротеинемические гемобластозы (множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей) представляют опухоли системы В-лимфоцитов (клеток, осуществляющих функции гуморального иммунитета). Главной особенностью гемобластоза является сохранение способности к дифференцировке до стадии иммуноглобулинсекретирующих клеток. Однако секретируемые иммуноглобулины отличаются однообразием структуры (моноклональный парапротеин PIg), что объясняется происхождением их из одного опухолевого клона клеток [3].

Множественная миелома характеризуется опухолевой пролиферацией плазматических клеток. Болезнь проявляется обычно у людей пожилого возраста, случаи заболевания в возрасте до 40 лет редки. Частота множественной миеломы составляет 3 на 100000 населения в год, мужчины болеют несколько чаще [1, 2, 3].

При диагностике множественной миеломы ведущими являются три критерия [1, 3]:

1. наличие более 10% плазматических клеток в миелограмме и/или плазмоклеточная инфильтрация в биоптате пораженных тканей;

2. моноклональный парапротеин при иммуноэлектрофорезе в сыворотке крови, содержащий либо иммуноглобулин G более 35 г/л либо иммуноглобулин А более 20 г/л; в моче или – легкие цепи более 0,05 г/сут; гиперпарапротеинемия более 15%.

3. наличие остеолитических поражений скелета и/или диффузный остеопороз.

Диагноз множественной миеломы ставится при сочетании не менее 2-х из 3-х вышеперечисленных признаков, наличие первого является обязательным.

Гиперпарапротеинемия связана с повышенной продукцией парапротеина, но для выявления моноклонального парапротеина необходимы дополнительные иммунологические исследования. При электрофорезе белков сыворотки крови у 80% больных с миеломной болезнью обнаруживается М-парапротеин. У 10% – гипогаммаглобулинемия, и у 10% изменения в белковом спектре отсутствуют. Иммуноэлектрофорез и иммуннофиксация – наиболее информативные методы, позволяющие уточнить наличие парапротеинемии более чем в 90% случаев. Иммуноэлектрофорез и иммуннофиксация мочи выявляет парапротеинурию у 80% больных при соотношении /=2/1. Характерными симптомами миеломной болезни является снижение уровня нормального иммуноглобулина сыворотки крови [5].

Наиболее близкими к предлагаемому изобретению является исследование белкового спектра сыворотки крови методом электрофореза и иммуноэлектрофореза. Электрофорез позволяет выявить наличие М-градиента (парапротеина – полоса моноклонального белка в зоне миграции глобулинов и снижение фракции вне этой зоны) и установить степень гиперпарапротеинемии. Иммуноэлектрофорез позволяет установить абсолютное количество иммуноглобулинов разных классов, в том числе PIg.

За прототип предлагаемого изобретения выбран способ диагностики гиперпарапротеинемии с помощью электрофореза белков сыворотки крови. Для исследования берут свежую негемолизированную сыворотку крови, полученную натощак. Предварительно определяют содержание общего белка биуретовым методом. Необходимое оборудование:

1) источник питания,

2) электрофоретическая камера с пластиковыми электродами,

3) анализатор фореграмм (денситометр),

4) аппликатор для нанесения образцов,

5) ацетатцеллюлозные мембраны (АЦМ),

6) емкости для окрашивания и отбеливания фонапластинок.

Ход определения: АЦМ помещают на поверхность электродного буфера так, чтобы они всасывали жидкость только снизу с помощью капиллярных сил. После извлечения из буфера АЦМ промокают между листами фильтровальной бумаги, не допуская высыхания. Смоченную в буфере АЦМ помещают в рамку, а затем в камеру для электрофореза. Образцы с помощью аппликатора наносятся на катодный край. После нанесения образцов подключается ток. Через 20 минут ток отключают и переносят АЦМ в красящий раствор, затем отмывают до отбеливания фона в растворе этилового спирта с уксусной кислотой. Просветление АЦМ проводят на аппарате ФОМК с использованием этилового спирта и ЛУК (ледяная уксусная кислота). Высушенную АЦМ сканируют на денситометре при длине волны 600 нм. Данные о содержании белковых фракций в сыворотке крови представляются в относительных единицах (%). О гиперпарапротеинемии судят по относительному количеству парапротеина более 10%. Недостатками способа-прототипа являются:

1) необходимость в специальной дорогостоящей аппаратуре,

2) необходимость в большом количестве дорогостоящих реактивов,

3) сложность исполнения анализа,

4) необходимость наличия специально оборудованной лаборатории,

5) большая продолжительность работы квалифицированного персонала (не менее 3 часов).

Интересен метод клиновидной дегидратации, позволяющий делать видимой молекулярную организацию биологических жидкостей путем перевода ее на макроуровень. После высыхания капли в стандартных условиях на твердой подложке количество солей увеличивается от периферии к центру, а количество органических веществ – от центра к периферии [8].

Среди патологических структур в фации сыворотки крови В.Н.Шабалин и С.Н.Шатохина [6] выделили системные и под системные аномалии. Основные системные нарушения в фации сыворотки крови проявляются в виде потери симметрии расположения основных ее элементов, изменения их формы или полном отсутствии. Данные изменения свидетельствуют о патологических процессах в организме, они не являются специфическими для конкретного заболевания, а отражают лишь тяжесть его течения. Нарушения подсистемного структуропостроения могут проявляться в виде следующих образований:

– структуры типа языков Арнольда и полей Серпинского, появляющиеся при воспалительных процессах любого характера;

– «морщины», образующиеся при повышенном содержании в крови белково-пептидных и белково-аминокислотных агрегатов;

– структуры типа листа, появляющиеся при атеросклеротическом поражении сосудов;

– бляшкообразные структуры, указывающие на повышенное содержание в организме экзо- и эндотоксинов;

– «трещины серебра», свидетельствующие о нарушении эластичности сосудов;

– «жгуты» в центральной зоне фации (трещины в виде колец, полуколец и волн), свидетельствующие о гипоксии, в первую очередь, головного мозга.

Системный анализ структуры фации сыворотки крови можно использовать для оценки состояния гомеостаза: нормальное или патологическое, устойчивое или нет [7]. Авторы не указывают на связь конкретных структур с биохимическими параметрами сыворотки крови.

В задачу предлагаемого изобретения положено удешевление и упрощении диагностики гиперпарапротеинемии.

Поставленная задача в способе диагностики гиперпарапротеинемии по результатам исследования сыворотки крови достигается тем, что сыворотку крови исследуют методом клиновидной дегидратации, при этом каплю сыворотки предварительно высушивают на предметном стекле и затем анализируют структуру полученной фации под микроскопом, и при наличии в центральной и/или промежуточной зонах фации аномальных сетчатых радиальных структур диагностируется средняя степень выраженности парапротеинемии, а при наличии отдельнолежащих «глыбок» и/или «глыбок», расположенных по краям трещин в центральной зоне фации, диагностируется высокая степень выраженности парапротеинемии.

Необходимое оборудование:

1) предметные стекла,

2) пипеточный микродозатор,

3) световой микроскоп.

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества в сравнении с прототипом:

1) упрощение (не требуется специальной дорогостоящей аппаратуры и реактивов),

2) удешевление (усредненная стоимость исследования белков крови методом электрофореза составляет 160 руб., а предлагаемого нами метода – 50 руб.),

3) ускорение (время работы с образцом составляет в среднем около 15 минут).

Нами обследовано 15 пациентов с парапротеинемией, выраженность которой указана в Табл. 1. Всем пациентам было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование. Сыворотка крови всех пациентов исследовалась методом клиновидной дегидратации. С помощью пипеточного микродозатора каплю сыворотки объемом 0,01 мл наносили на чистое предметное стекло. Эту каплю высушивали при комнатной температуре в закрытом шкафу. Через 18-24 часа полученную фацию рассматривали под микроскопом в проходящем свете.

У больных с низкой выраженностью парапротеинемии (менее 15%) были диагностированы рассеянный склероз (1 человек), онкозаболевания (3 человека). У пациентов со средней и высокой выраженностью парапротеинемии диагностирована множественная миелома.

При сопоставлении морфологической картины сыворотки крови и белкового спектра получены следующие данные: при низкой выраженности парапротеинемии (менее 15%) в фации сыворотки крови аномальные структуры не выявлялись. На фиг.1 представлены микрофотографии (Б – увеличение ×25, В – увеличение ×100) фации сыворотки крови больной К. с подозрением на паранеопластический синдром (13% парапротеина – диагностически незначимый уровень для диагностики множественной миеломы, А – фореграмма, стрелкой показана полоска, соответствующая М-градиенту), в которой отсутствуют аномальные структуры. При средней степени выраженности парапротеинемии (от 15 до 30%) во всех случаях в промежуточной и/или центральной зонах фации выявлялись аномальные сетчатые радиальные структуры, описание которых в доступной литературе отсутствует. На фиг.2 представлены микрофотографии (Б – увеличение ×25, В – увеличение ×100) фации сыворотки крови больного К. с множественной миеломой (25,6% парапротеина – диагностически значимый уровень для множественной миеломы, А – фореграмма, стрелкой показана полоска, соответствующая М-градиенту), аномальные сетчатые радиальные структуры в центральной зоне указаны стрелками. При высокой степени выраженности парапротеинемии (более 30%) во всех случаях выявлялись отдельнолежащие «глыбки» и/или «глыбки», расположенные по краям трещин в центральной зоне фации, описание которых в доступной литературе отсутствует. На фиг.3 представлены микрофотографии (Б – увеличение ×25, В – увеличение ×100) фации сыворотки крови больного X. с множественной миеломой (46% парапротеина – высокий уровень, А – фореграмма, стрелкой показана полоска, соответствующая М-градиенту), аномальные отдельнолежащие «глыбки» и «глыбки», расположенные по краям трещин в центральной зоне фации указаны стрелками.

При исследовании морфологической картины сыворотки крови 600 больных с различными заболеваниями (ИБС, калькулезный холецистит, аутоиммунные заболевания, неврологические заболевания, опухоли разных локализаций, хроническая почечная недостаточность) вышеописанные аномальные признаки обнаружены не были.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. У больных забирают кровь из локтевой вены натощак, центрифугируют ее в течение 10 минут при 1500 об/мин, сыворотку в количестве 0,01 мл с помощью пипеточного микродозатора наносят на чистое предметное стекло и высушивают при комнатной температуре в закрытом шкафу. Через 18-24 часа полученную фацию рассматривают под микроскопом в проходящем свете на малом увеличении. При наличии в промежуточной и/или центральной зоне фации аномальных сетчатых радиальных структур делают заключение о средней степени выраженности парапротеинемии (от 15 до 30%). При наличии аномальных отдельнолежащих «глыбок» и/или «глыбок» по краям трещин в центральной зоне фации делают заключение о высокой степени выраженности парапротеинемии (более 30%).

Необходимое оборудование: предметные стекла, пипеточный микродозатор, микроскоп с проходящим светом. Никакие реактивы не требуются. Способ дешев и прост в исполнении, не требует специального дорогостоящего оборудования и специально оборудованной лаборатории.

В качестве иллюстрации заявляемой диагностической технологии приводим примеры, подтверждающие практическое применение данной методики.

Больная X., 44 лет, находится под наблюдением гематологов с мая 2002 года, когда был впервые установлен диагноз множественная миелома, диффузно-очаговая форма, секретирующая IgG типа, парапротеинемическая почка ХПН_0-I, стероидный сахарный диабет. Диагноз подтверждался данными гистологического исследования трепанобиоптатов подвздошной кости и рентгенографией костей скелета (выявлялись очаги деструкции преимущественно в плоских костях, патологические переломы костей скелета – компрессионные переломы тел Th 9 и Th 10 позвонков). В миелограмме количество плазматических клеток составляло 20,8%. Неоднократно проводилась полихимиотерапия. Поступает 30.01.04 в гематологическое отделение НОКБ им. Н.А.Семашко с целью проведения очередного курса полихимиотерапии (и/б №0402701).

По данным лабораторного исследования: общий анализ крови – Hb-113 г/л, Er – 3,1·10¹²/л, ЦП-1,0, Ret 10%, Tr – 240·10³/л, СОЭ – 56 мм/час, Le – 3,9·10⁹/л, П – 1%, С – 70%, Эо – 1%, лимфоциты – 25%, моноциты – 3%; иммунограмма – IgA менее 0,6 г/л, IgM – 0,29 г/л, IgG – более 25,7 г/л; 2 – микроглобулин сыворотки – 4,9 мг/мл; фракции белков крови – альбумин 37%, альфа1 2%, альфа2 6%, бета 8%, парапротеин 46%, гамма 1%, общий белок 93 г/л; циркулирующие иммунные комплексы 30 ЕД/мл; общий белок в суточной моче 0,42 г/сут. Другие биохимические показатели крови были в пределах нормы.

При исследовании фации сыворотки крови выявлялись как отдельнолежащие «глыбки», так и «глыбки», расположенные по краям трещин в центральной зоне фации (фиг. 3).

Больная У., 46 лет, находится под наблюдением в неврологической клинике НОКБ им. Н.А.Семашко по поводу рассеянного склероза, цереброспинальная форма, ремитирующий тип течения. Больной считает себя в течение 10 лет, когда после физической нагрузки появилась слабость в нижних конечностях, больше справа. Диагноз был установлен в 2000 году с учетом клинико-неврологического обследования, данных анамнеза и результатов магнитно-резонансной томографии головного мозга (наличие очагов демиелинизации в перивентрикулярной области). Поступила 10.12.03 во 2-е неврологическое отдление НОКБ им. Н.А.Семашко с целью проведения очередного курса пульс-терапии глюкокортикостероидными препаратами в связи с обострением (и/б №0330703).

По данным лабораторного исследования: общий анализ крови – Hb – 132 г/л, Er – 4,42·10¹²/л, ЦП – 0,9, СОЭ – 13 мм/час, Le – 5,4·10⁹/л, сегментоядерные – 53,1%, лимфоциты – 40,7%, моноциты – 6,2%; иммунограмма – IgA 2,9 г/л, IgM – 1,75 г/л, IgG – 17,0 г/л; фракции белков крови – альбумин 59%, альфа1 2%, альфа2 16%, бета 19%, парапротеин 11%, гамма 10%, общий белок 70 г/л; циркулирующие иммунные комплексы 120 ЕД/мл. Другие биохимические показатели крови были в пределах нормы. Плазматические клетки при проведении стернальной пункции не выявлены. Иммуноэлектрофорез и иммуннофиксация крови и мочи патологических изменений не выявили. Данных за множественную миелому нет.

При исследовании фации сыворотки крови методом клиновидной дегидратации вышеописанные патологические структуры не выявлялись.

Источники информации

1. Алексеев Г.А., Андреева Н.Е. Миеломная болезнь. – М.: Медицина, 1966. – 246 с.

3. Клиническая онкогематология /Под. ред. М.А.Волковой. – М.: Медицина, 2001. – 572 с.

4. Клиническое использование опухолевых маркеров. Критическая оценка / Под. ред. Академика АМН ССР Н.Н.Трапезникова. – М.: НПО “Союзмединформ.”, 1989. – 76 с.

5. Титов В.Н., Амелюшкина В.А. Электрофорез белков сыворотки крови. М.: ОПТИМУМ ПРЕСС, 1994. – 63 с.

6. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека. – М.: Хризостом, 2001. – 304 с.

7. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., Шабалин В.В. Способ оценки состояния гомеостаза. – Патент РФ №2147124, 2000.

Формула изобретения

Способ диагностики гиперпарапротеинемии, включающий исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что сыворотку крови исследуют методом клиновидной дегидратации, при этом каплю сыворотки предварительно высушивают на предметном стекле и затем анализируют структуру полученной фации под микроскопом и при наличии в центральной и/или промежуточной зонах фации аномальных сетчатых радиальных структур диагностируют среднюю степень выраженности парапротеинемии, а при наличии отдельно лежащих «глыбок» и/или «глыбок», расположенных по краям трещин в центральной зоне фации, диагностируют высокую степень выраженности парапротеинемии.

РИСУНКИ

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 19.08.2008

Извещение опубликовано: 20.07.2010 БИ: 20/2010