Патент на изобретение №2272631

(54) СИНЕРГИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ВИЧ

(57) Реферат:

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается синергетической композиции, содержащей азидотимидин и пента-О-никотинат глицирризиновой кислоты – ниглизин, в концентрациях, физиологически достижимых в крови: для азидотимидина – 0,0037-0,0254 мкМ, для ниглизина – 0,0052-9,64 мкМ. Применение данной композиции позволяет эффективно подавлять репродукцию ВИЧ-1, при этом существенно снижаются затраты на лечение. Композиция обладает высокой биодоступностью и высокой эффективностью. 6 табл., 1 ил.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”reverse lipoatrophy in HIV-infected patients. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2003, 33 (1): 29-33.

Изобретение относится к вирусологии и медицине, а именно к разработке композиционных препаратов на основе азидотимидина и производных глицирризиновой кислоты, способных эффективно ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека при низких физиологических концентрациях входящих в них отдельных компонентов.

В условиях распространения эпидемии СПИДа проблема лечения этого опасного заболевания остается одной из актуальных проблем современной медицины. На протяжении уже почти 15 лет в клинической практике для лечения ВИЧ-инфекции широко используется азидотимидин (АЗТ) – эффективный ингибитор вирусной обратной транскриптазы [1]. В последние годы в связи с быстро развивающейся в организме ВИЧ-инфицированных пациентов резистентностью вируса к азидотимидину [2], а также из-за высокой токсичности препарата (в том числе митохондриальной токсичности) [3, 4] его применение ограничено. А монотерапия АЗТ в настоящее время не рекомендована Всемирной организацией здравоохранения, поскольку приводит к появлению устойчивых к препарату мутантов вируса.

В настоящее время в большинстве случаев азидотимидин применяют в качестве составляющего в так называемых «коктейлях» в сочетании с 2-4 другими препаратами [5, 6], воздействующими на другие мишени цикла репродукции вируса. Как правило, это ингибиторы протеазы ВИЧ или ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ. Несмотря на эффективность некоторых таких «коктейлей», актуальным остается поиск новых сочетаний-комбинаций азидотимидина с препаратами другой природы и иного механизма действия, достаточно эффективных и дешевых в производстве, пригодных для лечения ВИЧ-инфекции.

Одним из таких доступных и дешевых препаратов является глицирризиновая кислота (ГК), механизм действия которой некоторые авторы связывают с ингибированием протеинкиназы, обеспечивающей фосфорилирование Т4 рецептора, необходимого для связывания вируса [7], другие – с непосредственным блокированием связывания вируса с клеткой [8]. Хотя механизм анти-ВИЧ действия ГК остается невыясненным до конца, ясно одно, что она ингибирует репродукцию вируса на ранних стадиях инфекции [9] в отличие от азидотимидина.

Исследование «лечебного» действия ГК на модели хронической ВИЧ-инфекции в моноцитах человека линии U937 при длительном культивировании в ее присутствии показало, что ГК эффективно ингибирует продукцию вируса на первых 4-х пассажах, а далее до 20-го пассажа лишь на 60% снижает вируспродукцию по сравнению с контролем [10]. Использование комбинации АЗТ и ГК (1:1000) оказалось более эффективным: к 20-му пассажу вирусспецифический белок р24 не выявлялся [10].

Исследование противовирусной активности целого ряда производных ГК продемонстрировало эффективность их анти-ВИЧ действия в культуре клеток [11-13]. Ранее было показано, что моноаммониевая соль глицирризиновой кислоты (глицирам) не является антагонистом по отношению к азидотимидину и в сочетании с ним эффективно блокирует репродукцию ВИЧ в культуре клеток как при острой, так и при хронической инфекции при соотношении АЗТ:глицирам=1:10000 [9, прототип]. Однако эффективные концентрации АЗТ и глицирама являются довольно высокими и неприемлемы на уровне организма.

Технической задачей изобретения является разработка высокоэффективных анти-ВИЧ композиций на основе азидотимидина и производных глицирризиновой кислоты, обладающих синергическим эффектом входящих в него компонентов при физиологически допустимых концентрациях последних в крови.

Поставленная задача решается путем подбора и исследования противовирусной активности различных комбинаций АЗТ и нового отечественного препарата пента-О-никотината глицирризиновой кислоты (ниглизина) – эффективного ингибитора ВИЧ [14]. При подборе комбинаций компонентов новой синергической композиции необходимо учитывать фармакокинетику азидотимидина и глицирризиновой кислоты, согласно которой концентрации АЗТ не должны превышать 0,05-0,1 мкг/мл, а ГК – 2-10 мкг/мл, что соответствует реальным концентрациям этих соединений в крови [15].

В результате этого исследования показано, что АЗТ и ниглизин в комбинациях 1:20, 1:50, 1:100, 1:200 и 1:2000 проявляют выраженный синергический эффект (табл.1). Важно отметить, что если для АЗТ 50%-ные ингибирующие дозы в этих комбинациях варьируют незначительно (от 0,0056 до 0,014 мкМ) и мало отличаются от таковой для индивидуального препарата, то в случае ниглизина они существенно снижаются по мере уменьшения его доли в комбинации (от 2,076 до 0,0519 мкМ).

Таким образом, используя комбинации АЗТ с ниглизином, можно существенно снизить эффективные концентрации индивидуальных препаратов от 0,0254 до 0,0142 мкМ, что соответствует 0,0038 мкг/мл, и ниже (до 0,0037 мкМ) для АЗТ и от 9,64 до 0,052 мкМ (0,07 мкг/мл) для ниглизина, что значительно ниже физиологически достижимых в крови и нетоксичных концентраций этих соединений.

В экспериментах исследовалась противовирусная активность ниглизина и его комбинаций с АЗТ в отношении АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1, полученного в культуре клеток и характеризующегося снижением чувствительности к АЗТ в 160 раз и наличием точечных мутаций в гене pol Asp67Asn; Lys70Arg; Leu214Phe, ответственных за резистентность [17].

Ниглизин оказался более эффективным в отношении АЗТ-резистентного мутанта (ID₅₀=0,134 мкМ), чем в отношении «дикого» штамма (ID₅₀=9,64 мкМ). Определенный для комбинации АЗТ:ниглизин=1:100 комбинационный индекс FIC составил 0,553 (<1), что свидетельствует о синергическом противовирусном действии этой комбинации в отношении АЗТ-резистентного мутанта. Причем 50%-ные ингибирующие дозы препаратов в смеси были существенно ниже, чем для индивидуальных соединений: для АЗТ – 0,0037 мкМ, а для ниглизина – 0,052 мкМ.

Эффективность сочетанного анти-ВИЧ действия АЗТ и ниглизина как в отношении «дикого» штамма, так и АЗТ-резистентного мутанта свидетельствует о перспективности использования подобных композиций для лечения ВИЧ-инфекции.

Изобретение иллюстрируется следующей диаграммой.

Фиг.1. Эффективность ингибирования ВИЧ_EVK композицией АЗТ и ниглизина 1:50 в культуре клеток МТ-4.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Оценка анти-ВИЧ активности композиции азидотимидина и ниглизина 1:50.

Анти-ВИЧ-1 активность композиции изучают на высокочувствительной к вирусу иммунодефицита человека культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражают стоком вируса (штамм ВИЧ-l_EVK [18]) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку и инкубируют при 37°С в течение 1 часа (адсорбция вируса). Суспензию инфицированных клеток разводят ростовой питательной средой RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы фирмы “ICN” (США), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина, до посевной концентрации 0,5×10⁶ клеток/мл и вносят в лунки 96-луночного культурального планшета. Затем в лунки вносят аликвоты последовательных разведений азидотимидина в среде без добавок до конечных концентраций от 0,1 нг/мл до 1,0 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию), аликвоты последовательных разведений ниглизина в ДМСО до конечных концентраций от 0,05 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и смесь аликвот последовательных разведений азидотимидина и ниглизина, конечные концентрации азидомидина в которых от 1,0 нг/мл до 1,0 мкг/мл, а ниглизина – от 0,05 до 50 мкг/мл (по три лунки на каждый вариант). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивируют при 37°С и 5% CO₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано в [19].

Экпериментальные данные приведены на Фиг.1. На основе полученных в эксперименте количественных данных строят дозозависимые кривые, из которых определяют ингибирующие дозы ((ID₅₀) – концентрацию соединения, на 50% снижающую накопление вирусного антигена р24 по сравнению с контролем) для индивидуальных соединений и для каждого соединения в смеси. Полученные таким образом количественные характеристики используют далее для расчета комбинационного индекса (FIC), определяемого согласно [16] по формуле:

где А – азидотимидин, В – ниглизин.

Количественные данные ингибирования репродукции вируса композицией и индивидуальными соединениями представлены в табл.2. Комбинационный индекс равен 0,574 (<1), что свидетельствует о синергетическом анти-ВИЧ действии азидотимидина и ниглизина в соотношении 1:50.

Пример 2. Оценка анти-ВИЧ активности композиции азидотимидина и ниглизина 1:20.

Анти-ВИЧ-1 активность композиции изучают на высокочувствительной к вирусу иммунодефицита человека культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражают, разводят ростовой питательной средой до посевной концентрации и вносят в лунки культурального планшета, как описано в примере 1. Затем в лунки вносят аликвоты последовательных разведений азидотимидина в среде без добавок до конечных концентраций от 0,1 нг/мл до 1,0 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию), аликвоты последовательных разведений ниглизина в ДМСО до конечных концентраций от 0,02 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и смесь аликвот последовательных разведений азидотимидина и ниглизина, конечные концентрации азидомидина, в которых от 1,0 нг/мл до 1,0 мкг/мл, а ниглизина – от 0,02 до 20 мкг/мл (по три лунки на каждый вариант). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивируют при 37°С и 5% СО₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано в [19]. На основе полученных в эксперименте количественных данных строят дозозависимые кривые, из которых определяют ингибирующие дозы (ID₅₀) и рассчитывают комбинационный индекс (FIC), как описано выше в примере 1. Количественные данные ингибирования репродукции вируса композицией и индивидуальными соединениями представлены в табл.3. Комбинационный индекс равен 0,56 (<1), что свидетельствует о синергетическом анти-ВИЧ действии азидотимидина и ниглизина в соотношении 1:20.

Пример 3. Оценка анти-ВИЧ активности композиции азидотимидина и ниглизина 1:100 в отношении АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1.

Анти-ВИЧ-1 активность композиции изучают на высокочувствительной к вирусу иммунодефицита человека культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражают АЗТ-резистентным мутантом ВИЧ-1 с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку и инкубируют при 37°С в течение 1 часа (адсорбция вируса). Суспензию инфицированных клеток разводят ростовой питательной средой до посевной концентрации и вносят в лунки культурального планшета, как описано в примере 1. Затем в лунки вносят аликвоты последовательных разведений азидотимидина в среде без добавок до конечных концентраций от 0,1 нг/мл до 0,1 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию), аликвоты последовательных разведений ниглизина в ДМСО до конечных концентраций от 0,1 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и смесь аликвот последовательных разведений азидотимидина и ниглизина, конечные концентрации азидомидина в которых от 0,1 нг/мл до 0,1 мкг/мл, а ниглизина – от 1 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждый вариант). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивируют при 37°С и 5% СО₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано в [19]. На основе полученных в эксперименте количественных данных строят дозозависимые кривые, из которых определяют ингибирующие дозы (ID₅₀) и рассчитывают комбинационный индекс (FIC), как описано выше в примере 1. Количественные данные ингибирования репродукции АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1 композицией и индивидуальными соединениями представлены в табл.4. Комбинационный индекс равен 0,553 (<1), что свидетельствует о синергическом анти-ВИЧ действии азидотимидина и ниглизина в таком соотношении 1:100.

Количественные характеристики ингибирования ВИЧ-1_EVK и АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ-1 композициями АЗТ и ниглизина приведены в итоговой Таблице 1.

Пример 4. Оценка анти-ВИЧ активности композиции азидотимидина и ниглизина 1:200.

Анти-ВИЧ-1 активность композиции изучают на высокочувствительной к вирусу иммунодефицита человека культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражают, разводят ростовой питательной средой до посевной концентрации и вносят в лунки культурального планшета, как описано в примере 1. Затем в лунки вносят аликвоты последовательных разведений азидотимидина в среде без добавок до конечных концентраций от 0,5 нг/мл до 0,5 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию), аликвоты последовательных разведений ниглизина в ДМСО до конечных концентраций от 0,1 до 200 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и смесь аликвот последовательных разведений азидотимидина и ниглизина, конечные концентрации азидомидина в которых от 0,5 нг/мл до 0,5 мкг/мл, а ниглизина – от 0,1 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждый вариант). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивируют при 37° и 5% СО₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано в [19]. На основе полученных в эксперименте количественных данных строят дозозависимые кривые, из которых определяют ингибирующие дозы (ID₅₀) и рассчитывают комбинационный индекс (FIC), как описано выше в примере 1. Количественные данные ингибирования репродукции вируса композицией и индивидуальными соединениями представлены в табл.5. Комбинационный индекс равен 0,614 (<1), что свидетельствует о синергетическом анти-ВИЧ действии азидотимидина и ниглизина в соотношении 1:200.

Пример 5. Оценка анти-ВИЧ активности композиции азидотимидина и ниглизина 1:2000.

Анти-ВИЧ-1 активность композиции изучают на высокочувствительной к вирусу иммунодефицита человека культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражают, разводят ростовой питательной средой до посевной концентрации и вносят в лунки культурального планшета, как описано в примере 1. Затем вносят в лунки аликвоты последовательных разведений азидотимидина в среде без добавок до конечных концентраций от 0,5 нг/мл до 0,5 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию), аликвоты последовательных разведений ниглизина в ДМСО до конечных концентраций от 0,1 до 200 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и смесь аликвот последовательных разведений азидотимидина и ниглизина, конечные концентрации азидомидина в которых от 0,5 нг/мл до 0,1 мкг/мл, а ниглизина – от 1 до 200 мкг/мл (по три лунки на каждый вариант). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивируют при 37°С и 5% СО₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано в [19]. На основе полученных в эксперименте количественных данных строят дозозависимые кривые, из которых определяют ингибирующие дозы (ID₅₀) и рассчитывают комбинационный индекс (FIC), как описано выше в примере 1.

Количественные данные ингибирования репродукции вируса композицией и индивидуальными соединениями представлены в табл.6. Комбинационный индекс равен 0,435 (<1), что свидетельствует о синергетическом анти-ВИЧ действии азидотимидина и ниглизина в таком соотношении 1:2000.

Таким образом впервые показано, что предлагаемые композиции ниглизина с АЗТ способны эффективно подавлять репродукцию как «дикого» штамма, так и АЗТ-устойчивого мутанта ВИЧ-1 в культуре чувствительных к вирусу клеток, проявляя при этом синергический эффект. Учитывая, что ниглизин является эффективным индуктором интерферона-гамма [20], можно надеяться существенно усилить его терапевтический потенциал при лечении ВИЧ-инфекции. Это позволяет рекомендовать такого рода композиции («коктейли») для разработки новых эффективных отечественных средств лечения ВИЧ-инфекции, которые могут существенно (примерно в 50 раз) снизить затраты общества и самих больных на лечение.

Список литературы

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х т. Т.2. Изд. 14-е, Москва: ООО «Новая волна». – 2000.

12. Патент РФ №2199547, кл. С 07 J 63/00, опубликован БИ №6 за 2003 г.

13. Патент РФ №2198177, кл. С 07 J 63/00, опубликован БИ №4 за 2003 г.

14. Авторское свидетельство СССР №1804848, кл. А 61 К 31/705, опубликовано БИ №12, за 1993 г.

20. Заявка на патент РФ №2003134868 (037495), приоритет от 01.12.2003 г. “Индуктор гамма-интерферона”.

Формула изобретения

Синергическая композиция для ингибирования ВИЧ, характеризующаяся тем, что она содержит азидотимидин и пента-О-никотинат глицирризиновой кислоты – ниглизин, в концентрациях, физиологически достижимых в крови: для азидотимидина 0,0037-0,0254 мкМ, для ниглизина 0,0052-9,64 мкМ.

РИСУНКИ

TK4A Поправки к публикациям сведений об изобретениях в бюллетенях “Изобретения (заявки и патенты)” и “Изобретения. Полезные модели”

Напечатано: (73) Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (RU)

Следует читать: (73) Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Номер и год публикации бюллетеня: 9-2006

Код раздела: FG4A

Извещение опубликовано: 20.11.2009 БИ: 32/2009