Патент на изобретение №2272293

(54) СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ АКТИВНОЙ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН

(57) Реферат:

Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быть использовано для диагностики активной хламидийной инфекции у беременных женщин. Сущность изобретения состоит в том, что в сыворотке крови определяют антитела IgG к рекомбинантному белку Pgp3 Chlamydia trachomatis и при их обнаружении диагностируют активную хламидийную инфекцию. Техническим результатом является повышение точности диагностики активной хламидийной инфекции у беременных женщин. 4 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”inflammatory disease, ectopic pregnancy, and laboratory diagnosed Chlamydia psittaci/Chlamydia pneumoniae infection. J. Clin. Pathol. 2003 Mar; 56(3):225-229. HONKONEN E. et al. Chlamydia trachomatis in term pregnancy, isolation and serological study with a case report. Int. J. Gynaecol. Obstet. 1983 Dec; 21(6):473-476.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, конкретно к способам серологической диагностики активной хламидийной инфекции у беременных методом иммуноферментного анализа.

Известен способ диагностики активности хламидиоза методом иммуноферментного анализа, основанный на обнаружении в сыворотке крови антител IgM и IgG к родоспецифическому липополисахаридному антигену (LPS-антиген) [1]. Наличие LPS характерно также для состава наружной мембраны грамм-отрицательных бактерий [2]. Это объясняет низкую специфичность этого способа при обследовании на инфекцию, вызванную Chlamydia trachomatis, и малая информативность в диагностике активного процесса.

В настоящее время применяется способ ИФА диагностики активной хламидийной инфекции, основанный на обнаружении в сыворотке крови антител IgM к рекомбинантному белку МОМР Chlamydia trachomatis [3].

МОМР – главный (основной) белок наружной мембраны, встречается у всех представителей Chlamydia trachomatis, составляет 60% от всех поверхностных белков микроорганизма, несет на себе также функцию порина, обеспечивает жесткость оболочки элементарного тельца хламидии. Антитела против МОМР подавляют антилизосомальную активность хламидии при внутриклеточном паразитизме. Наиболее часто в сыворотке определяются антитела к главному белку наружной мембраны. Как самый иммуногенный, МОМР является основой для создания диагностических иммуноферментных тестов. Однако IgM дают перекрестную реакцию с изогемагглютининами (анти А, анти В), ревматоидным фактором, холодовыми агглютининами. Уровень IgM повышается при коллагенозах, энтеропатии, паразитарных заболеваниях, при наличии холодовых агглютининов [4]. Во время беременности отмечается нарушение механизма переключения синтеза IgM на IgG, что может проявляться снижением уровня IgM и IgA. Гуморальный иммунитет претерпевает фазность: повышен в ранние сроки и снижен в более поздние сроки беременности. Все эти особенности затрудняют диагностику активной хламидийной инфекции во время беременности, тем самым, приводя к ошибкам в лечебной тактике.

Новая техническая задача – повышение точности способа.

Поставленную задачу решают новым способом диагностики активной хламидийной инфекции у беременных путем определения антител Chlamydia trachomatis в сыворотке крови, причем определяют антитела IgG к рекомбинантному белку Pgp3 Chlamydia trachomatis и при их обнаружении диагностируют активную хламидийную инфекцию у беременных.

Pgp3 – мембран-ассоциированный белок, кодируемый общей плазмидой Chlamydia trachomatis, которая присутствует в большинстве штаммов и клинических изолятов. Высокая экспрессия плазмидной ДНК характерна лишь для фазы активной вегетации [5]. Будучи антиген-значимым для иммунной системы, этот белок может быть использован для серодиагностики хламидийных заболеваний. Антитела к нему были обнаружены у детей и взрослых с генитальной и глазной хламидийной инфекцией. В контрольной группе здоровых доноров антител к pgp3 обнаружено не было [6].

Способ осуществляют следующим образом.

Используемый в данном случае вариант ИФА относится к неконкурентному ИФА для определения антител в исследуемом образце при помощи ферментмеченного антиглобулина.

Рекомбинантный антиген pgp3 С.trachomatis L2, клонируют в Е. Coli-p1248, вектором pEV40 (производство Invitrogen, San Diego, Calif.). Затем белок очищают аффинной хроматографией с использованием Ni 2+ хроматографической колонки. Чистоту полученного белка анализируют в SDS-полиакриламидном геле (12,5%), используя окрашивание Coomassie blue (Sigma). Чистота составляла 95-98%. Полученный белок хранят в буфере (8М мочевина, 10 mM Tris, (-mercatoethanol) при 2-10°С.

Сорбцию рекомбинантного белка осуществляют на микропланшеты PolySorb (Nunc, Denmark), по 100 l в лунку при концентрации белка – 0,5-2 мкг/мл, в 0,05М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе (КББ) (рН 9,6). Инкубируют при 2-10°С в течение 16 ч. Блокировку осуществляют 1% БСА (бычий сывороточный альбумин, Sigma) и 3% сахарозой (Sigma) при комнатной температуре (20-25°С), 1 час, по 150 l в лунку. После сушки плашки промывают однократно, в течение 5 минут, фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) (рН 7,4), содержащим 0,05% Tween 20 (PBS-T). Сыворотку для исследования получают по стандартной методике. Проводят забор 5 мл венозной крови из локтевой вены натощак. Исследуемые сыворотки вносят по 100 l в лунку, в разведении 1:20. Затем после 30 минутной инкубации при 37°С, осуществляют промывку 5 раз PBS-Т. Связавшиеся специфические комплексы IgG к pgp3 выявляют моноклональным конъюгатом против IgG человека (Bio-Rad, Calif.) в разведении 1:10000. После 30 минутной инкубации, микропланшеты промывают 5-кратно PBS-T. Окрашивание окончательного продукта реакции осуществляют тетраметилбензидином (Sigma) по инструкции производителя. Цветную реакцию останавливают добавлением 50 l 1М H₂SO₄, после 30 минутной инкубации при комнатной температуре, в темноте. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре TECAN на 450 нм. И при обнаружении антител IgG к рекомбинантному белку Pgp3 Clamydia trachomatis диагностируют активную хламидийную инфекцию.

Pgp3 – мембран-ассоциированный белок, кодируемый общей плазмидой Chlamydia trachomatis, которая присутствует в большинстве штаммов и клинических изолятов. Высокая экспрессия плазмидной ДНК характерна лишь для фазы активной вегетации [5]. Будучи антиген-значимым для иммунной системы этот белок может быть использован для серодиагностики хламидийных заболеваний. Антитела к нему были обнаружены у детей и взрослых с генитальной и глазной хламидийной инфекцией. В контрольной группе здоровых доноров антител к pgp3 обнаружено не было [6].

Под наблюдением находились 37 беременных женщин с подтвержденным диагнозом урогенитальный хламидиоз во время беременности методом ПЦР (“АмплиСенс Chlamydia trachomatis” НИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва).

Сыворотки материнской и пуповинной крови, взятой в родах, были исследованы методом ИФА на хламидийные белки МОМР и pgp3. Положительный результат только на IgG к pgp3 зарегистрирован в 9 материнских сывороток и парных им образцов пуповинной крови (группа 1). Отрицательный результат дали 28 пар сывороток мать/плод (группа 2).

При изучении экстрагенитального анамнеза заболеваемости в группе с положительным результатом pgp3 отмечена тенденция к увеличению частоты атопических проявлений (дерматит), ВСД по кардиальному типу. Подобная тенденция наблюдается и в отношении болезней легких, таких как хронические бронхит и пневмония, хотя размеры выборки не позволяют говорить о статистически значимых различиях между группами. Достоверно можно говорить только о значительном повышении уровня урогенитальной патологии в первой группе (Таблица 1).

Для пациенток с наличием антител к pgp3 в сыворотке крови характерны следующие особенности. Это беременные с хроническим пиелонефритом и заболеваниями легких в анамнезе. Воспалительные заболевания органов малого таза и послеабортные эндометриты в анамнезе можно расценивать как клинические проявления хронической урогенитальной инфекции хламидийной этиологии.

Беременность у женщин из группы pgp3+ осложняется, как правило, гестозом с ранним началом, угрозой прерывания в первом триместре, обострениями пиелонефрита и частыми кольпитами, что также говорит об обострении этой хронической инфекции. Для них характерна низкая плацентация и плацентарная недостаточность, что объясняется изменениями в эндометрии вследствие перенесенного ранее эндометрита или внутриматочного инфицирования в ранние сроки настоящей беременности (Таблица 2). В испытуемой группе, как правило, развивалась субинволюция матки. В отсутствие аномилий родовой деятельности крупного плода можно предположить инфекционно-воспалительную этиологию этого осложнения и объяснить отсутствие эндометрита лишь проведением полноценной антибактериальной терапии (Таблица 3). Также свидетельством активной инфекции может служить и сравнительно высокий уровень инфекционных осложнений у новорожденных из группы pgp3+ (Таблица 4).

Преимущества предлагаемого способа заключаются в повышении точности и информативности при диагностике хламидийной инфекции. Обнаружение анти-pgp3 антител дает возможность определить стадию инфекционного процесса, что позволит выбрать оптимальную лечебную тактику. Данный способ может быть рекомендован для применения в акушерской практике для прогнозирования осложнений беременности, послеродового периода и заболеваемости новорожденных хламидийной этиологии.

Источники информации

Таблица 1 АНАМНЕСТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОБСЛЕДОВАННЫХ ГРУПП
	Частота заболеваемости в группах (%)		Корелляционный анализ
Заболеваемость	группа I n=9	группа II n=28	rs	PI
Атопия	22,20%	12,50%	0,26	0,13
Хронические заболевания легких	22,20%	4,20%	0,41	0,01
Эндокринная патология	33,30%	37,50%	0,09	0,6
Сердечно-сосудистые заболевания	22,20%	8,30%	0,33	0,06
Болезни почек	66,70%	8,30%	0,66	0,00002
Воспалительные заболевания органов малого таза	77,80%	58,30%	0,28	0,1
Невынашивание	22,20%	12,50%	0,2	0,26
Послеабортный эндометрит	33,30%	4,20%	0,5	0,003
Примечания: rs – коэффициент ранговой корреляции Спирмена между положительным анализом на pgp3 и наличием данного заболевания в анамнезе. Критическое значение коэффициента Спирмена при уровне значимости () 0,05 для выборки n=37 равно 0,325. PI – достоверность корреляции.

Формула изобретения

Способ серологической диагностики активной хламидийной инфекции у беременных путем определения антител к Chlamydia trachomatis в сыворотке крови, отличающийся тем, что определяют антитела IgG к рекомбинантному, белку Pgp3 Chlamydia trachomatis и при их обнаружении диагностируют активную хламидийную инфекцию у беременных.