Патент на изобретение №2272287
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОЗАН-КИСЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии – способам определения фармакологически активных веществ в биологических объектах. Предлагается способ количественного определения фенозан-кислоты в сложном многокомпонентном биологическом материале, заключающийся в том, что анализируемую пробу биожидкости (кровь, моча) после подкисления до рН=1 обрабатывают для извлечения определяемого вещества органическим экстрагентом. Фенозан-кислоту, содержащуюся в сухом остатке после упаривания экстракта, с целью увеличения летучести переводят в ее метиловый эфир, к которому добавляют раствор додекана, используемого в качестве внутреннего стандарта. Полученный раствор анализируют методом хромато-масс-спектрометрии при следующем температурном режиме: начальная температура колонки 75°С поддерживается без изменения 2 мин после ввода пробы, далее увеличивается до 280°С со скоростью 50 град/мин и поддерживается постоянной до конца программы. Концентрацию фенозан-кислоты определяют по предварительно построенному калибровочному графику. Технический результат: обеспечение возможности количественного определения фенозан-кислоты в плазме крови или моче после внутривенного или внутримышечного введения или после применения таблеток препарата, возможность его использования при выполнении клинических или фармакокинетических исследований препарата, а также при изучении его метаболизма. 3 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии – способам определения фармакологически активных веществ в биологических объектах. Фенозан-кислота (4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенилпропионовая кислота) является синтетическим антиоксидантом и изучается в качестве потенциального лекарственного препарата [Трещенкова Ю.А., Голощапов А.Н., Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты: Тез. докл. V Межд. конф. – М., 1998, С.182-183]. Однако данный способ не может быть использован для определения фенозан-кислоты в биологических объектах, поскольку невозможно с необходимой достоверностью предварительно определить общее базисное содержание эндогенных антиоксидантов у каждого животного. Задачей изобретения является обеспечение возможности количественного определения фенозан-кислоты в сложном многокомпонентном биологическом материале. Это достигается за счет того, что анализируемую пробу биожидкости после подкисления до рН=1 обрабатывают органическим экстрагентом для извлечения фенозан-кислоты, после чего переводят ее в метиловый эфир, к которому добавляют раствор додекана, анализируют методом хромато-масс-спектрометрии при следующем температурном режиме: начальную температуру колонки 75°С поддерживают без изменения 2 мин после ввода обработанной пробы биожидкости, далее температуру увеличивают до 280°С со скоростью 50 град/мин, концентрацию фенозан-кислоты определяют по калибровочному графику. Подкисление анализируемой пробы биожидкости до рН=1 необходимо для того, чтобы полностью подавить ионизацию фенозан-кислоты и тем самым обеспечить полный переход ее в органическую фазу в процессе экстракции. Перевод фенозан-кислоты в ее метиловый эфир осуществляется для того, чтобы повысить летучесть определяемого вещества. Предлагаемый температурный режим газожидкостного хроматографирования аналита необходим потому, что именно в этих условиях происходит удовлетворительное разделение пиков фенозан-кислоты, внутреннего стандарта и эндогенных соединений. Способ осуществляют следующим образом. К сухому остатку после эфирной экстракции биожидкости добавляют раствор диазометана. После завершения дериватизации эфир удаляют и к сухому остатку прибавляют хроматографически чистый внутренний стандарт, представляющий собой раствор додекана, например, в метаноле с концентрацией 15 нг/мкл. Пробу полученного раствора сразу же вводят в хромато-масс-спектрометр (например, газовый хроматограф HP 5980 серия II, масс-селективный детектор HP 5971 А и станция обработки данных HP 59970 С). Пробу анализируют при следующем температурном режиме: начальную температуру колонки 75°С поддерживают без изменения 2 мин после ввода обработанной пробы биожидкости, далее температуру увеличивают до 280°С со скоростью 50 град/мин, концентрацию фенозан-кислоты определяют по калибровочному графику. Пример. Количественное определение фенозан-кислоты в плазме крови кроликов (модельные растворы). Раствор “стандартной плазмы” готовят из лиофилизированной сухой плазмы добавлением соответствующего количества дистиллированной воды, перемешивания, настаивания, фильтрации. Основной стандартный раствор фенозан-кислоты концентрации 1 мг/мл готовят растворением точно взвешенного количества воздушно-сухого вещества в метаноле. Растворы-метчики получают разведением основного раствора: концентрация метчика от 10 до 1000 мкг/мл в соответствии с данными табл.1. 100 мкл каждого метчика добавляют к 1 мл плазмы для приготовления калибровочных растворов фенозан-кислоты с содержанием от 1 до 100 мкг/мл (Сплазмы). Для каждого значения концентрации готовят три раствора. “Нулевой” раствор содержит 100 мкл чистого метанола в плазме. После введения метчика растворы в плазме выдерживают не менее 1 ч при 20°С для установления равновесия. Фенозан-кислоту из калибровочных растворов и из биожидкостей выделяют экстракцией эфиром после подкисления растворов до рН=1, эфирные экстракты упаривают в токе воздуха при 40°С. К сухим экстрактам добавляют по 1 мл эфирного раствора диазометана, смеси оставляют на 12 ч. После завершения дериватизации эфир удаляют в токе воздуха, к высушенному остатку приливают от 50 до 200 мкл раствора внутреннего стандарта, а затем 0,6-1,0 мкл полученного раствора сразу же вводят в хроматограф (Сгх). Воспроизводимость хромато-масс-спектрометрического определения оценивали по стандартному раствору Сгх, содержащему 12,5 нг/мкл метилового эфира фенозан-кислоты (концентрация хроматографируемого раствора Сгх) и 10 нг/мкл внутреннего стандарта, при числе повторностей, равном 7: Воспроизводимость методики оценивали по стандартному раствору 4 мкг/мл фенозан-кислоты в плазме (Спл) при числе повторностей, равном 7: В табл.2 приведены результаты калибровки. Объединенное уравнение регрессии для интервала концентраций 0,5-100 мкг/мл имеет вид: Спл=0,245Q+1,515 мкг/мл, коэффициент линейной регрессии r=0,998. Для интервала концентраций 0,5-0,01 мкг/мл: Спл=0,097Q-0,0051 мкг/мл, коэффициент линейной регрессии r=0,989. Для оценки методики в целом независимо приготовленный раствор – стандартный образец фенозан-кислоты в плазме концентрации 4 мкг/мл – был проанализирован среди серии калибровочных растворов. В табл.3 приведены значения определенных по калибровочному графику и рассчитанных концентраций фенозан-кислоты, Стандартная статистическая обработка полученных результатов показала их достоверность и высокую воспроизводимость для Из табл.3 видно, что предлагаемый способ количественного определения фенозан-кислоты в биологических объектах методом хромато-масс-спектрометрии обладает высокой чувствительностью и воспроизводимостью, он позволяет надежно и достоверно определять в биологическом материале количественное содержание фенозан-кислоты в различные интервалы времени после его введения. Разработанный способ может быть использован для количественного определения фенозан-кислоты в плазме крови или моче после внутривенного или внутримышечного введения или после применения таблеток препарата.
Формула изобретения
Способ количественного определения фенозан-кислоты, 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенилпропионовой кислоты в биологических жидкостях, характеризующийся тем, что анализируемую пробу биожидкости после подкисления до рН=1 обрабатывают органическим экстрагентом для извлечения фенозан-кислоты, после чего переводят ее в метиловый эфир, к которому добавляют раствор додекана, анализируют методом хромато-масс-спектрометрии при следующем температурном режиме: начальную температуру колонки 75°С поддерживают без изменения 2 мин после ввода обработанной пробы биожидкости, далее температуру увеличивают до 280°С со скоростью 50 град/мин, концентрацию фенозан-кислоты определяют по калибровочному графику.
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 05.11.2006
Извещение опубликовано: 20.06.2008 БИ: 17/2008
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
=1,4; доверительный интервал 16,5±1,4; W=9,2%.
– коэффициент Стьюдента при n=7, 
С, составляет 2%.
