Патент на изобретение №2271813

(54) СПОСОБ КОРРЕКЦИИ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и биологии и заключается в том, что опухоленосителю per os ежедневно дают препарат «олигохит актив» из расчета 20-24 мг на кг веса, общим курсом не менее 7 дней. Способ позволяет устранить дистрофические изменения в гепатоцитах, вызванные нарушениями обмена в организме опухоленосителя, улучшить пролиферативную активность гепатоцитов и восстановить микроциркуляцию. 1 табл.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии и касается нормализации морфологического состояния печени опухоленосителей.

При злокачественных новообразованиях различной этиологии выявлены циркуляторные сдвиги, дистрофические и атрофические процессы в печени [15]. Дистрофические изменения проявлялись в набухании, вакуолизации печеночных клеток и нарушении балочной структуры. Постоянно наблюдался выраженный полиморфизм и неравномерность окраски ядер печеночных клеток. Развитие лимфосаркомы (ЛФС) Плисса приводило к нарушению функциональных свойств митохондрий печени крыс [14]. В процессе роста и развития опухоли в клетках печени опухоленосителя наблюдалось нарушение энергетического обмена (снижение содержания АТФ) [7, 20], окислительно-восстановительных процессов [2, 7], происходило ослабление дыхания [2, 3, 7, 8, 17], снижение окислительного фосфорилирования [7, 18] и ускорение гликолиза [18].

Опухолевый рост не является чисто местным процессом, в него вовлекаются все органы и ткани, весь организм в целом. В печени организма, пораженного злокачественной опухолью, возникает ряд серьезных и взаимосвязанных нарушений в структуре гепатоцитов, разных сторонах их метаболизма и, как следствие этого, в функциональном состоянии печени опухоленосителей [1, 14, 15]. В печени опухоленосителей наряду с дистрофическими и некротическими изменениями очень рано начинают проявляться регенерационные процессы. Однако компенсаторно-восстановительные реакции в организме, пораженном злокачественным новообразованием, ограничены и не приводят к полному восстановлению всех нарушенных функций [1].

Для нормализации морфологического состояния печени используется хорионический гонадотропин [11], экстракт вытяжки коры надпочечников [16] и комплекс препаратов с экстрактом вытяжки коры свиных и фетальных надпочечников человека [10].

Однако известные средства разработаны и предложены для нормализации состояния печени не в условиях опухоленосительства, а при отравлении четыреххлористым углеродом.

В доступной нам литературе мы не обнаружили ни одного способа коррекции морфологического состояния печени опухоленосителей. В связи с этим выбрать прототип изобретения не представляется возможным.

В задачу предлагаемого изобретения положена разработка способа коррекции морфологического состояния печени опухоленосителей.

Поставленная задача достигается тем, что опухоленосителю ежедневно per os дают препарат «олигохит актив» из расчета 20-24 мг на 1 кг веса, общим курсом не менее 7 дней.

В источниках информации подобного способа коррекции морфологического состояния печени опухоленосителей лимфосаркомы Плисса не обнаружено. Поэтому авторы полагают, что техническое решение является новым и соответствует критерию «изобретательный уровень».

Способ коррекции морфологического состояния печени опухоленосителей лимфосаркомы Плисса осуществляли в эксперименте на 44 белых беспородных крысах.

Модель неоплазии создавали путем перевивки опухолевого штамма ЛФС Плисса, приобретенного в ОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. ЛФС Плисса – экспериментальная опухоль, была получена в 1958 году после подкожной перевивки опухоли, возникшей у крысы, получавшей 3,3-дихлорбензидин. Кусочки опухолевой ткани диаметром 1 мм с 0,5-1 мл физиологического раствора вводились подкожно в область правого бедра.

Опухоль состоит из мягких, округлой формы клеток, большая часть которых занята крупным ядром. Хроматин располагается главным образом в периферической зоне ядра. Ядрышки крупные, гиперхромные. Цитоплазма опухолевых клеток отличается умеренной базофилией. Опухоль обладает ярко выраженным инфильтративным ростом. Инфильтрует пограничные соединительную и жировую ткань, а также мышцы. В опухоли встречаются очаги некроза, которые в отдельных участках сливаются.

Морфологические изменения в печени крыс с лимфосаркомой Плисса проявлялись в дискомплексации печеночных балок, полиморфизме гепатоцитов и их ядер. Наблюдались округление и некоторое обособление Купферовских клеток с отчетливой гиперхромией их ядер, очаговые некрозы, размеры которых колебались, занимая в одних участках лишь одну, в других несколько клеток. Выявлялось гидропическое перерождение клеток печени: цитоплазма клеток становилась очень светлой и разреженной, но ядра располагались центрально, границы клеток были четко очерчены. В ответ на дистрофические изменения и гибель паренхимы отмечены воспалительные процессы в печени. Для коррекции морфологического состояния печени при опухолевом росте необходимо стимулировать эндогенные возможности организма, направленные на снижение токсического воздействия опухоли на организм.

На 3 сутки развития опухоли (размер ее к этому времени составлял 1 см в диаметре) все экспериментальные животные были разделены на 7 групп:

1 группа – интактная (8 крыс). Животные не подвергались никаким воздействиям.

2 группа – контрольная (6 крыс). Животные с ЛФС, без воздействия.

3 группа – животные с ЛФС, которые с 3 дня развития опухоли начинали пить по 30-40 мл раствора янтарной кислоты с концентрацией 800 мг/л в течение 7 дней.

4 группа – животные с ЛФС, которые с 3 дня развития опухоли начинали пить по 30-40 мл водного раствора «олигохит сукцината» с концентрацией 800 мг/л в течение 7 дней.

5 группа – животные с ЛФС, которые с 3 дня развития опухоли начинали пить по 30-40 мл раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 800 мг/л в течение 7 дней.

6 группа – животные с ЛФС, которые с 3 дня развития опухоли начинали пить по 30-40 мл водного раствора «олигохит аскорбата» с концентрацией 800 мг/л в течение 7 дней.

7 группа – животные с ЛФС, которые с 3 дня развития опухоли начинали пить по 30-40 мл водного раствора «олигохит актив» с концентрацией 800 мг/л в течение 7 дней.

Комплекс изучаемых препаратов был выбран не случайно.

В физиологических условиях янтарная кислота диссоциирована, поэтому название ее аниона – сукцинат часто применяют как синоним термина «янтарная кислота».

Исследования последних лет показали наличие у сукцината биологической активности с уникальным сочетанием проявлений: по отношению к здоровому организму он выступает в роли адаптогена, а при наличии патологических проявлений демонстрирует нетипично высокий для адаптогенов терапевтический эффект [4]. Сукцинат является нормальным клеточным метаболитом, играет большую роль в обеспечении энергетического баланса в клетке [3, 4], обладает антигипоксическим [6], антиоксидантньм [4] и радиопротекторным [5] действиями, устраняет метаболический ацидоз, ослабляет токсическое действие ряда лекарственных средств [19]. Показано применение сукцината в лечении онкологических больных [3].

Аскорбиновая кислота стимулирует процесс образования коллагена, этим способствуя поддержанию нормальной проницаемости капилляров; принимает участие в обменных процессах, являясь переносчиком водорода; контролирует белковый обмен; влияет на скорость образования ДНК; контролирует биохимические реакции в клетках центральной нервной системы; оказывает стабилизирующее действие на молекулы адреналина путем их защиты от окисления; повышает фагоцитарные свойства крови за счет нарастания фагоцитарной активности лейкоцитов.

В последние годы в различных областях медицины широко применяется хитозан и его производные. Хитозан получают путем переработки морских ракообразных, а после ферментативного расщепления высокомолекулярного хитозана образуется новый, водорастворимый продукт – олигосахарид хитозана (олигохит^ТМ). В таком виде он легко абсорбируется в кишечнике и быстро попадает в системный кровоток, а затем с током крови доносится к «органам-мишеням».

Олигохит сукцинат (ОС) представляет собой комплекс олигосахарид хитозана и сукцината посредствам ионной связи, которая в желудочно-кишечном тракте легко распадается на составляющие компоненты, а олигохит усиливает всасывание сукцината [9]

Олигохит актив (ТУ 9289-004-57184729-03) представляет собой водорастворимый продукт, в котором олигосахарид хитозана (0,25 г), сукцинат (0,05 г) и аскорбат (0,05 г) находятся в ионной связи друг с другом.

Животных всех экспериментальных групп забивали на 10 день развития опухоли и 7 день получения препаратов.

Для гистологического исследования кусочки печени всегда брали из правой боковой доли печени крыс и фиксировали в 10% нейтральном формалине. На гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, наряду с визуальным описанием паренхимы печени для объективной оценки эффекта вводимых препаратов проводили количественное изучение гепатоцитов методами морфометрического анализа, основанного на принципах стереологии с использованием окулярной морфометрической сетки Стефанова С.Б., содержащей 25 узлов, при увеличении микроскопа 10×40×1,5, с использованием рекомендаций по количественной морфологии биоктатов органов пищеварения [12].

На площади препарата, ограниченной сеткой, подсчитывали количество нормальных ядер гепатоцитов округлой или овальной формы, хорошо структурированных, с четкими ядрышками.

Доверительный интервал колебания средней арифметической величины при р=0,05 определяли по формуле и таблицам Р.Б.Стрелкова [13].

При статистической обработке результатов для оценки значимости цифровых данных использовали t-критерий Стьюдента.

Анализ состояния паренхимы патологически измененной печени животных-опухоленосителей разных экспериментальных групп показал наиболее выраженную степень нормализации структуры печени животных, получавших комплекс «олигохит актив» из расчета 20-24 мг на 1 кг веса, общим курсом не менее 7 дней.

Морфологические изменения в печени крыс с лимфосаркомой Плисса проявлялись в дискомплексации печеночных балок, полиморфизме гепатоцитов и их ядер. Наблюдались округление и некоторое обособление Купферовских клеток с отчетливой гиперхромией их ядер, очаговые некрозы, размеры которых колебались, занимая в одних участках лишь одну, в других несколько клеток. Выявлялось гидропическое перерождение клеток печени: цитоплазма клеток становилась очень светлой и разреженной, но ядра располагались центрально, границы клеток были четко очерчены. В ответ на дистрофические изменения и гибель паренхимы отмечены воспалительные процессы в печени.

Морфологические исследования показали, что у крыс-опухоленосителей количество ядер гепатоцитов на тест-площади препарата резко снижено по сравнению с интактными: 3,4±0,3 и 8,3±0,5 (см. таблицу).

У животных, получавших сукцинат, наблюдалась слабая дистрофия гепатоцитов с очагами некрозов, незначительной круглоклеточной инфильтрацией в области сосудов, но, по сравнению с опухоленосителями, при визуальной оценке гистологических препаратов большинство паренхиматозных клеток печени были хорошо окрашены, с крупными ядрами. Морфометрические исследования не выявили достоверных различий в количестве нормальных ядер гепатоцитов (4,1±0,4) у животных этой группы по сравнению с крысами-опухоленосителями, не подвергавшимися воздействию препарата.

Исследования показали, что при использовании «олигохит сукцината» на фоне сходных морфологических изменений в печени крыс после введения только сукцината отмечали отделение стенок синусоидов от балок печени и расширение пространств Диссе. У отдельных крыс наблюдали диффузную мелкокапельную жировую инфильтрацию. Отмеченное расширение перисинусоидальных пространств может быть следствием циркуляторной недостаточности и повышенной проницаемости стенок синусоидов. Местами наблюдали скопление лимфоцитов, свидетельствующие об очаговых некрозах клеток печени.

Морфометрические исследования показали достоверное увеличение числа нормальных ядер гепатоцитов у этих крыс – 4,6±0,4 по сравнению с опухоленосителями (3,4±0,3).

Морфологическая картина печени животных, получавших аскорбиновую кислоту, была сходной с морфологической картиной печени животных, получавших сукцинат. Однако наблюдалось повышение активности соединительной ткани, проявляющееся в пролиферации клеток Купфера. По сравнению с животными контрольной группы достоверно увеличивалось количество нормальных ядер гепатоцитов до 4,5±0,2.

При введении препарата олигохит аскорбат также наблюдали повышение активности клеток Купфера.

Важно отметить, что изменение состояния клеток Купфера отражает многие неспецифические и специфические реактивные сдвиги в ткани печени. К наиболее часто наблюдаемым неспецифическим реакциям в печени относятся округление и некоторое обособление купферовских клеток с отчетливой гиперхромией их ядер.

Вместе с тем, в этой группе экспериментальных животных по сравнению с животными контрольной группы нормализуется паренхима печени: клетки и ядра гепатоцитов хорошо окрашены, дистрофические изменения и нарушения микроциркуляторного русла не выражены. Количество нормальных гепатоцитов на тест-площади препарата увеличилось в 1,59 раза по сравнению с контрольными животными и составило 5,32±0,36. Но положительный эффект отмечали лишь в 66,7% случаев (у 4 крыс из 6 в группе).

Введение «олигохит актива» стимулировало у животных выраженные регенерационные процессы, о чем свидетельствовало большое количество двуядерных гепатоцитов с увеличенными гиперхромными ядрами, с плотной базофильной цитоплазмой. Большинство ядер гепатоцитов содержали 2-3 крупных ядрышка.

Морфометрические исследования подтвердили, что количество нормальных ядер гепатоцитов у животных, получавших комплексный препарат «олигохит актив» увеличивается до 5,52±0,28 (контрольная группа 3,4±0,3). Важно отметить, что в этой экспериментальной группе животных выявлен 100% положительный эффект. В среднем количество нормальных гепатоцитов увеличилось по сравнению с животными-опухоленосителями без воздействия в 1,65 раза.

Таким образом, сравнительное изучение биологического действия различных веществ на модели патологически измененной печени опухоленосителей выявило наибольший выраженный эффект на нормализацию структуры печени при введении животным-опухоленосителям комплекса «олигохит актив», что позволяет предложить данный способ для коррекции морфологического состояния печени опухоленосителей (табл.1).

Пример №1.

Крысе №13, весом 200 г ввели подкожно в область правого бедра 0,5 мл физиологического раствора с кусочками опухолевого штамма лимфосаркомы (ЛФС) Плисса диаметром 1 мм, приобретенного в НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (г.Москва).

На третьи сутки развития опухоли (размер ее к этому времени составил 0,7 см в диаметре) крыса стала получить в поилке водный раствор содержимого капсулы препарата «олигохит актив» с концентрацией 800 мг/л. Каждый день в течении 7 дней крыса выпивала от 30 до 40 мл раствора, что составляло 20-24 мг на 1 кг веса. Раствор в поилке меняли на свежеприготовленный каждый день в 10 утра.

Через 10 дней после перевивки опухолевого штамма ЛФС Плисса и 7 дней получения препарата «олигохит актива» провели декапитацию крысы под эфирным наркозом. Опухоль была 3×3 см, весом 9 г. Для гистологического исследования взяли кусочек печени из правой боковой доли, зафиксировали в 10% нейтральном формалине. После приготовления парафиновых срезов печени толщиной 4-6 мкм их окрасили гематоксилином с эозином по общепринятой методике. На площади препарата, ограниченного сеткой, оказалось 5.4±0.48 нормальных ядер гепатоцитов округлой или овальной формы, хорошо структурированных, с четкими ядрышками.

Под влиянием препарата усиливалась пролиферативная активность гепатоцитов. Количество нормальных ядер гепатоцитов увеличилось в 1,6 раза по сравнению с опухоленосителями, не получавшими препараты.

Вместе с тем нормализовалась паренхима печени: клетки и ядра гепатоцитов были хорошо окрашены, дистрофические изменения в гепатоцитах и нарушение микроциркуляционного русла не были выражены. На препаратах печени этой крысы было отмечено большое количество двуядерных печеночных клеток, гепатоцитов с увеличенными гиперхромными ядрами, содержащими по 2-3 крупных ядрышка, что свидетельствует о выраженных репарационных процессах в печени.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

7. Морозкина Т.С. Системное действие опухоли на процессы энергетического обмена хозяина: Автореф. дис. д-ра мед. наук. – Минск, 1978. – 42с.

9. Олигосахарид хитозана сукцинат. – Доступно по www.oligopharm@sandy.ru.

10. Садовникова И.В., Шиленок И.Г., Садовникова В.В., Мухина И.В., Панина Н.А., Иванова Н.Л. Способ стимуляции регенерации печеночной ткани. Патент РФ на изобретение №2185835 от 27.07.2002 г.

11. Солопаева И.М. Хорионический гонадотропин в биологии и медицине. Монография. – Н.Новгород: Изд-во ННГУ им. Н.И.Лобачевского, 2000. – 192 с.

12. Солопаева И.М., Стефанов С.Б., Жданова Т.Ф. Количественная морфология биоктатов органов пищеварения / Методич. рекомендации. – Горький, 1982. – 16 с.

13. Стрелков Р.Б. Метод вычисления стандартной ошибки и доверительного интервала средних арифметических величин с помощью таблиц. – Сухуми: Алашара, 1966. – 12 с.

Формула изобретения

Способ коррекции морфологического состояния печени опухоленосителя, заключающийся в том, что опухоленосителю per os ежедневно дают препарат «олигохит актив» из расчета 20-24 мг на 1 кг веса, общим курсом не менее 7 дней.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 19.10.2006

Извещение опубликовано: 20.06.2008 БИ: 17/2008