Патент на изобретение №2271219

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБИНОПОДОБНЫХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ЯДА ЗМЕИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности, а именно к производству лекарственных и диагностических препаратов из яда змей, и может быть использовано в диагностических и лечебных целях, в частности, для оценки времени свертывания крови или для лечения и профилактики тромбозов и подобных патологий. Способ характеризуется тем, что растворенный в буферном растворе яд подвергают поэтапной хроматографии на Сефадексе G-100, на катионообменнике СМ-Toyopearl 650М с линейным градиентом концентрации хлорида натрия и полным объемом градиента, обеспечивающими наиболее полное выявление и раздельное элюирование тромбиноподобных ферментов, затем проводят раздельную рехроматографию этих ферментов, задавая линейные градиенты концентрации хлорида натрия из условий элюирования соответствующего тромбиноподобного фермента на предыдущем этапе при одновременном увеличении полных объемов этих градиентов до уровня, обеспечивающего дополнительное разделение соседних тромбиноподобных ферментов, и получают целевой продукт в гомогенном состоянии после раздельной очистки тромбиноподобных ферментов на сорбенте ABA-TSK. Способ обеспечивает получение тромбиноподобных ферментов, позволяет повысить выход ферментов и активность целевого продукта за счет увеличения количества выделяемых ферментов и последующей их раздельной очистки для получения целевого продукта в гомогенном состоянии. 5 табл.

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности, а именно к производству лекарственных и диагностических препаратов из яда змей, и может быть использовано в диагностических и лечебных целях, в частности, для оценки времени свертывания крови или для лечения и профилактики тромбозов и подобных патологий.

Известен способ получения тромбиноподобных ферментов (ферментов, обладающих коагулирующей активностью) из сырого яда змей рода Agkistrodon (Соловьев Д.А., Угарова Т.П. Выделение и характеристика

Недостатком прототипа является как низкий уровень удельной коагулирующей активности целевого продукта, так и низкий количественный выход ферментов. Прототип не позволяет выделить более двух ферментов из одного источника.

Задачей изобретения является создание способа получения тромбиноподобных ферментов, позволяющего повысить количественный выход ферментов и конечную коагулирующую активность целевого продукта за счет увеличения количества выделяемых ферментов и последующей их раздельной очистки для получения целевого продукта в гомогенном состоянии.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе получения тромбиноподобных ферментов из яда змеи путем хроматографии, согласно изобретению растворенный в буферном растворе яд подвергают поэтапной хроматографии на Сефадексе G-100, на катионообменнике СМ-Toyopearl 650М с линейным градиентом концентрации хлорида натрия и полным объемом градиента, обеспечивающими наиболее полное выявление и раздельное элюирование тромбиноподобных ферментов, затем проводят раздельную рехроматографию этих ферментов, задавая линейные градиенты концентрации хлорида натрия из условий элюирования соответствующего тромбиноподобного фермента на предыдущем этапе при одновременном увеличении полных объемов этих градиентов до уровня, обеспечивающего дополнительное разделение соседних тромбиноподобных ферментов, и получают целевой продукт в гомогенном состоянии после раздельной очистки тромбиноподобных ферментов на сорбенте ABA-TSK.

Исследования с использованием яда змеи Agkistrodon acutus показали, что хроматография на Сефадексе G-100 позволяет провести более полное удаление из сырого яда высокомолекулярных и низкомолекулярных ингибиторов тромбиноподобных ферментов и других балластных компонентов, препятствующих выявлению полной коагулирующей активности на начальном этапе очистки. В результате уже на этом этапе очистки уровень выявляемой коагулирующей активности повышается в 2-13 раз по сравнению с прототипом. Мягкие ионообменные условия хроматографии на CM-Toyopearl 650M позволяют, варьируя линейным градиентом концентрации хлорида натрия (градиент NaCl) и его полным объемом, разделить до семи тромбиноподобных ферментов, элюирующихся в определенном порядке по ходу нарастания концентрации NaCl. Зависимость количества полученных тромбиноподобных ферментов от градиента NaCl и его полного объема представлена в табл.1.

Исследования показали, что при линейном градиенте NaCl от 0 М до 0,3-0,4 М и полном объеме градиента соответственно 750 мл – 1000 мл выделяется до 7 ферментов. Это наиболее полное количество ферментов, получаемых из яда змеи Agkistrodon acutus предлагаемым способом. При градиенте NaCl 0,1-0,4 и полном объеме градиента 750 мл выделяется всего 5 ферментов, а при градиенте 0,15-0,4 М и полном объеме 625 мл получается всего лишь 1-2 пика коагулирующей активности, то есть не удается разделение ферментов и соответственно коагулирующая активность целевого продукта не возрастает. Раздельное элюирование позволяет отделить тромбиноподобные ферменты с высокой активностью от таковых с низкой активностью. Причем, чем больше выделено тромбиноподобных ферментов, тем более точно выделяются высокоактивные. Повторную катионообменную хроматографию (рехроматографию) проводят на CM-Toyopearl 650M раздельно для каждого тромбиноподобного фермента, причем с более медленным нарастанием концентрации NaCl за счет увеличения полного объема градиента NaCl в 1,4-1,6 раза. При этом границы линейного градиета NaCl определяют исходя из условий элюирования соответствующего тромбиноподобного фермента на предыдущем этапе. Это позволяет удалить из промежуточных фракций фермента как соседние элюирующиеся ферменты, так и оставшиеся ингибирующие и балластные белки. Такая дополнительная очистка каждого из ферментов на CM-Toyopearl 650M в условиях, соответствующих только их индивидуальным физико-химическим характеристикам, приводит к увеличению уровня активности (для наиболее активных – в 11-15 раз, при выходе 10-19%). На заключительном этапе очистки препарат каждого фермента подвергают хроматографии на сорбенте ABA-TSK. Этот сорбент содержит в качестве лиганда ингибитор сериновых протеаз. Из доступных источников авторам не известно применение сорбента ABA-TSK для очистки тромбиноподобных ферментов. Исследования показали, что сорбент ABA-TSK является высокоспецифичным в отношении тромбиноподобных ферментов. Каждый фермент имеет свои балластные белки. В связи с этим, на последнем этапе очистки, когда приходится удалять из индивидуального промежуточного препарата фермента балластные и ингибиторные белки, сопутствующие только данному ферменту (а не их смеси) для каждого фермента подбирают индивидуальные условия хроматографии. В результате уровень активности целевого продукта при очистке наиболее активных ферментов поднимается до 1100 NIH/мг и выше. Хроматография отдельных ферментов, а не их смеси, значительно упрощает контроль хроматографии и позволяет повысить коагулирующую активность целевого продукта за счет раздельной очистки каждого из высокоактивных тромбиноподобных ферментов до 8-14%. Кроме того, раздельная очистка позволяет выделить в гомогенном состоянии новые тромбиноподобные ферменты, отличающиеся по своим физико-химическим свойствам.

Способ может быть осуществлен следующим образом.

Сырой яд змеи Agkistrodon acutus растворяют в 0,05 М буфере ацетата аммония (рН 6,8). Нерастворимые компоненты удаляют центрифугированием при 10000-15000 g в течение 20-30 мин. Надосадочную фракцию хроматографируют на колонке Сефадекса G-100 (высотой 90-100 см), заполненную тем же буфером. Элюирующиеся фракции, обладающие коагулирующей активностью, объединяют и вводят в колонку CM-Toyopearl 650M (высотой 110-120 см), заполненную 0,05 М буфером ацетата аммония (рН 6,5). Элюирование осуществляют линейным градиентом NaCl от 0 М до 0,3-0,6 М. Составляющие линейный градиент NaCl растворы готовят в отношении 1:1 при полном объеме градиента соответственно 750 мл – 1500 мл. Полученные в результате элюирования фракции, обладающие коагулирующей активностью, объединяют согласно соответствующему им пику элюирования. Пики в профиле коагулирующей активности отражают место элюирования ферментов из колонки CM-Toyopearl 650M. С этого момента объединенные фракции нумеруются согласно очередности элюции из колонки (например, как E_n, где n=1, 2… 7,… и так далее) и называются условно фермент E_n (где n=1, 2… 7… и так далее). Объединенные фракции каждого фермента уравновешивают 0,05 М буфером ацетата аммония (рН 6,5) и удаляют ионы NaCl с помощью ультрафильтрационной мембраны. На этом этапе можно проводить полное удаление солевых ионов и лиофилизацию препарата с целью отсроченной последующей очистки. Полученный уравновешенный раствор частично очищенного фермента подвергают повторной хроматографии (рехроматографии) на колонке CM-Toyopearl 650M в тех же условиях, что и на предыдущем этапе, устанавливая лишь новые границы градиента NaCl. Границы градиента NaCl на этом этапе задаются исходя из условий элюирования соответствующего тромбиноподобного фермента на предыдущем этапе очистки (а именно, при первой хроматографии CM-Toyopearl 650M). Каждый из растворов, составляющих градиент NaCl, готовят в 1,4-1,6 раза больше, чем на предыдущем этапе очистки, и в отношении 1:1 друг другу. После элюции фракции соответствующие основанию основного пика профиля коагулирующей активности объединяют. Эта процедура приводит к окончательному отделению фермента E_n от соседних по элюированию ферментов E_n-1 и E_n+1. Объединенные фракции фермента E_n уравновешивают буфером последующего этапа, удаляя ионы NaCl с помощью ультрафильтрационной мембраны. На этом этапе можно проводить полное удаление солевых ионов и лиофилизацию препарата с целью отсроченной последующей очистки. После вышеописанной подготовки препарат фермента E_n вводят в колонку ABA-TSK сорбента и элюирование выполняют плавным градиентом NaCl от 0 М до 0,5 М. Элюирующиеся фракции, обладающие коагулирующей активностью, объединяют. Полученный препарат представляет очищенный до гомогенного состояния индивидуальный тромбиноподобный фермент E_n из яда змеи Agkistrodon acutus. Этот препарат может быть подвергнут очистке от солевых ионов и последующей лиофилизации для хранения.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Пример. 500 мг сырого яда змеи A. acutus растворяют в 3 мл 0,05 М ацетат аммония буфера (рН 6,8) и центрифугируют при 12000 g в течение 20 мин. Надосадочную фракцию наносят на колонку Сефадекс G-100 (размером 2,8×97 см), забуференную тем же раствором. Элюирование осуществляют тем же раствором со скоростью 17 мл/час. Размер собираемых фракций 5 мл. Фракции, содержащие коагулирующую активность, идентифицируют, определяя время свертывания фибриногена (к 0,27 мл 5%-ного фибриногена быка, прибавляется 0,03 мл элюата). Собрано 13 фракций. Общий объем 65 мл. Его вводят в колонку CM-Toyopearl 650M (размером 1,7×115,5 см), уравновешенную 0,05М буфером ацетата аммония (рН 6,5), и затем осуществляют элюирование линейным градиентом NaCl от 0М до 0,4М. Составляющие градиент растворы готовят в объеме 500 мл каждый. Элюирование осуществляют со скоростью 30 мл/час. Объем собираемых фракций 2,5 мл. В диапазоне фракций №120-212 элюата выявляется 7 пиков коагулирующей активности (условно обозначаемые 1, 2…7). Объединяют фракции, соответствующие каждому пику, и проводят раздельную очистку путем рехроматографии и хроматографии на сорбенте. Результаты хроматографии представлены на примере получения ферментов, обозначенных Е₃, Е₅, Е₆ и Е₇.

Для получения фермента Е₆ 8 фракций (№179-186), соответствующие ферменту Е₆, объединяют, удаляют NaCl и уравновешивают буфером ацетата аммония (рН 6,5) с помощью ультрафильтрационной мембраны. Полученный раствор фермента Е₆ снова вводят в колонку CM-Toyopearl 650M (размером 1,7×115,5 см), уравновешенную 0,05 М буфером ацетата аммония (рН 6,5). Элюирование осуществляют линейным градиентом NaCl с 0,04 М до 0,14 М в соответствии с условиями элюирования фермента Е₆ на предыдущем этапе. Составляющие градиент растворы готовят в объеме 750 мл каждый. Остальные условия рехроматографии прежние. Фракции элюата №335-375 обладают коагулирующей активностью и соответствуют ферменту Е₆. Эти фракции объединяют и с помощью ультрафильтрацирнной мембраны уравновешивают 0,03 М ацетат-аммонийным буфером (рН 7,0). Полученный белковый раствор вводят в колонку сорбента ABA-TSK (размером 1×10 см). Элюирование выполняют градиентом NaCl с 0 М до 0,5 М. Скорость элюирования 1 мл/мин. Объем фракций 1 мл. Фракции, имеющие коагулирующую активность, вышедшую в диапазоне 61-75 мин, представляют гомогенный тромбиноподобный фермент Е₇ из яда змеи Agkistrodon acutus. Этот продукт показывает при электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия одну полосу. Результаты определения коагулирующей активности в процессе очистки представлены в табл.2 (данные пересчитаны на 1454 мг сырого яда).

Для получения фермента Е₇ 23 фракции (№187-209), соответствующие ферменту Е₇, объединяют, удаляют NaCl и уравновешивают буфером ацетата аммония (рН 6,5) с помощью ультрафильтрационной мембраны. Полученный раствор фермента Е₇ снова вводят в колонку CM-Toyopearl 650M (размером 1,7×115,5 см), уравновешенную 0,05 М буфером ацетата аммония (рН 6,5).

Элюирование осуществляют линейным градиентом NaCl с 0,05 М до 0,15 М в соответствии с условиями элюирования на предыдущем этапе. Составляющие градиент растворы готовят в объеме 750 мл каждый. Остальные условия рехроматографии прежние. Фракции элюата №235-270 обладают коагулирующей активностью и соответствуют ферменту Е₇. Эти фракции объединяют и с помощью ультрафильтрационной мембраны уравновешивают 0,03 M ацетат-аммонийным буфером (рН 7,0). Полученной белковый раствор вводят в колонку (размером 1×10 см) ABA-TSK сорбента. Элюирование выполняют градиентом NaCl с 0 М до 0,5 М. Скорость элюирования 1 мл/мин. Объем фракций 1 мл. Фракции, имеющие коагулирующую активность, вышедшую в диапазоне 25-45 мин, представляют тромбиноподобный фермент Е₇ из яда змеи Agkistrodon acutus. Этот продукт показывает при электрофорезе в полиакриламиднои геле с додецилсульфатом натрия одну полосу. Результаты определения коагулирующей активности в процессе очистки представлены в табл.3 (данные пересчитаны на 1454 мг сырого яда).

Для получения фермента E₅ 9 фракций (№170-178), соответствующие ферменту E₅, объединяют, удаляют NaCl и уравновешивают буфером ацетата аммония (рН 6,5) с помощью ультрафильтрационной мембраны. Полученный раствор фермента E₅ снова вводят в колонку CM-Toyopearl 650 M (размером 1,7×115,5 см), уравновешенную 0,05 М буфером ацетата аммония (рН 6,5). Элюирование осуществляют линейным градиентом NaCl с 0,03 М до 0,13 М в соответствии с условиями элюирования фермента E₅ на предыдущем этапе. Составляющие градиент растворы готовят в объеме 750 мл каждый. Остальные условия рехроматографии прежние. Фракции элюата №247-303 обладают коагулирующей активностью и соответствуют ферменту E₅. Эти фракции объединяют и с помощью ультрафильтрационной мембраны уравновешивают 0,03 М ацетат-аммонийным буфером (рН 7,0). Полученный белковый раствор вводят в колонку ABA-TSK сорбента (размером 1×10 см). Элюирование выполняют градиентом NaCl с 0 M до 0,5 М. Скорость 1 мл/мин. Объем фракций 1 мл. Фракции, имеющие коагулирующую активность, вышедшую в диапазоне 19-38 мин, представляют гомогенный тромбиноподобный фермент E₅ из яда змеи Agkistrodon acutus. Этот продукт показывает при электрофорезе в полиакриламиднои геле с додецилсульфатом натрия одну полосу. Результаты определения коагулирующей активности в процессе очистки представлены в табл.4 (данные пересчитаны на 1454 мг сырого яда).

Для получения фермента Е₃ 7 фракций (№155-161), соответствующие ферменту Е₃, объединяют, удаляют NaCl и уравновешивают буфером ацетата аммония (рН 6,5) с помощью ультрафильтрационной мембраны. Полученный раствор фермента Е₃ снова вводят в колонку CM-Toyopearl 650M (размером 1,7×115,5 см), уравновешенную 0,05 М буфером ацетата аммония (рН 6,5). Элюирование осуществляют линейным градиентом NaCl от 0,01 М до 0,11 М. Составляющие градиент растворы готовят в объеме 750 мл каждый. Остальные условия рехроматографии прежние. Фракции элюата №268-282 обладают коагулирующей активностью и соответствуют ферменту Е₃. Эти фракции объединяют и с помощью ультрафильтрационной мембраны уравновешивают 0,03 М ацетат-аммонийным буфером (рН 7,0). Полученный белковый раствор вводят в колонку сорбента ABA-TSK (размером 1×10 см). Элюирование выполняют градиентом NaCl от 0 М до 0,5 М. Скорость элюирования 1 мл/мин. Объем фракций 1 мл. Фракции, имеющие коагулирующую активность, представляют гомогенный тромбинрподобный фермент Е₃ из яда змеи Agkistrodon acutus. Этот продукт показывает при электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия одну полосу. Результаты определения коагулирующей активности в процессе очистки представлены в табл.5 (данные пересчитаны на 1454 мг сырого яда).

Из табл.2-5 видно, что уже на этапе хроматографии на Сефадексе G-100 уровень коагулирующей активности повышается в 2-13 раз по сравнению с коагулирующей активностью целевого продукта в прототипе. Как отмечалось выше, это может быть связано с удалением высокомолекулярных и низкомолекулярных ингибиторов тромбиноподобных ферментов. Эффект очистки еще более усиливается на этапе хроматографии и рехроматографии на СМ-Toyopearl 650M. Последнее связано с отделением ферментов с высокой активностью от таковых с низкой активностью. При этом способ выявляет и позволяет выделить более 2 ферментов из яда змеи Agkistrodon acutus, возможность чего полностью отсутствует в прототипе. Работа же с индивидуальным ферментом, вероятно, резко облегчает проведение и дополнительную очистку на последнем этапе (сорбент ABA-TSK), когда уровень активности возрастает на 100%.

Таким образом, благодаря раздельной очистке наиболее активных ферментов способ позволяет увеличить уровень активности конечного препарата тромбиноподобного фермента из яда змеи Acustrodon acutus более чем в 45-55 раз (до 1100-1400 NIH/мг) по сравнению с прототипом. Выход конечного препарата фермента равен не менее 8-14%, что в 8-14 раз выше чем у прототипа. Выделение полного спектра ферментов обеспечивает целенаправленное создание поливалентной сыворотки для нейтрализации последствий укусов змей, а также может служить экспериментальной моделью для изучения механизма действия тромбина.

Способ может применяться для получения тромбиноподобных ферментов из ядов других змей. Оптимальные условия проведения хроматографии подбираются в предварительных экспериментах для каждого конкретного яда.

Формула изобретения

Способ получения тромбиноподобных ферментов из яда змеи рода Agkistrodon acutus, включающий растворение яда в буферном растворе, отделение растворимых компонентов от нерастворимых компонентов и последующую поэтапную хроматографию на Сефадексе, на ионообменнике с линейным градиентом концентрации хлорида натрия и на сорбенте, отличающийся тем, что растворенный в буферном растворе яд отделяют центрифугированием от нерастворимых компонентов при 10000-15000 g, далее надосадочную жидкость хроматографируют на Сефадексе G-100, фракции, содержащие коагулирующую активность, идентифицируют, собирают, проводят хроматографию на катионобменнике СМ-Toyopearl 650 М с линейным градиентом концентрации хлорида натрия от 0 до 0,3-0,4 М при полном объеме градиента соответственно от 750 мл до 1000 мл, объединяют фракции, соответствующие каждому из разделенных ферментов, проводят повторную хроматографию на катионобменнике CM-Toyopearl 650 М раздельно для каждого тромбиноподобного фермента при увеличении полного объема градиентов хлорида натрия в 1,4-1,6 раза, при этом границы градиента задают, исходя из условий элюирования соответствующего тромбиноподобного фермента на предыдущем этапе, и получают целевой продукт в гомогенном состоянии после раздельной очистки тромбиноподобных ферментов на сорбенте АВА-TSK плавным градиентом хлорида натрия от 0 до 0,5 М.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 29.07.2006

Извещение опубликовано: 20.12.2007 БИ: 35/2007