Патент на изобретение №2270868

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИКОПИНА, ФОСФОЛИПИДОВ, ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ЭРГОСТЕРИНА ПУТЕМ СОВМЕСТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (+) И (-) ШТАММОВ ГРИБА Blakeslea trispora

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается производства витаминов и антиоксидантов, в частности производства ликопина, фосфолипидов, жирных кислот и эргостерина. Сущность изобретения заключается в том, что при совместном глубинном культивировании пары гриба Blakeslea trispora Б-1(-) и Б-2(+) на минеральной среде с глюкозой через 26 часов культивирования накапливается до 40 мг/г АСВ ликопина, на среде с гидролом и кукурузным экстрактом через 30 часов от начала культивирования – до 50 мг/г АСВ ликопина. Для получения биологически активных соединений (ликопина, эргостерина, фосфолипидов и жирных кислот) биомассу отделяют от культуральной жидкости и высушивают. Экстракцию липидов из биомассы проводят гидрофобным растворителем. Отделяют полученный экстракт от биошрота путем его горячей фильтрации. Кристаллизацию ликопина ведут в среде того же органического растворителя, что и процесс экстракции. Кристаллы ликопина отделяют фильтрованием. Выход кристаллического ликопина в результате проведения способа составляет 70-72% от содержания его в биомассе. После отделения кристаллов ликопина последовательно осуществляют следующие стадии: выделения и очистки фосфолипидов; выделения и очистки жирных кислот; выделения и очистки эргостерина. Преимуществом изобретения является повышение выходов целевых продуктов, а также упрощение и удешевление процесса экстракции. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается производства витаминов и антиоксидантов, в частности производства ликопина, эргостерина, фосфолипидов, жирных кислот.

В настоящее время установлено, что биологически активные соединения, такие как ликопин, эргостерин, фосфолипиды, жирные кислоты и др., успешно используются для лечения и профилактики различных заболеваний.

Ликопин относится к классу природных соединений – каротиноидам. Это пигмент, который придает здоровую красную окраску фруктам и овощам, таким как помидоры, арбузы, розовые грейпфруты, облепиха и др. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что ликопин наряду с красящей функцией имеет самостоятельное значение как биологически активная добавка. Ликопин оказывает общеукрепляющее действие на организм и обладает большим набором ценных фармакологических свойств. Подавляя в организме свободнорадикальное окисление, ликопин стабилизирует иммунный статус организма, улучшает протекание ряда важнейших биологических процессов в организме, в том числе нормализует уровень глюкозы в крови, липидный обмен, зрение и контролирует пролиферацию (новообразование) клеток. Была установлена высокая эффективность использования ликопина при лечении заболеваний предстательной железы, легких, желудка, катаракты, ишемической болезни сердца, атеросклероза [1-3]. Биологическая активность ликопина связана, прежде всего, с его антиоксидантными свойствами, т.е. способностью ингибировать свободнорадикальные процессы в клетках. При этом было показано, что ликопин обладает более выраженной способностью устранять вредное воздействие синглетного кислорода по сравнению с -каротином [4].

Эргостерин – предшественник витамина Д₂, который получается при облучении эргостерина ультрафиолетовыми лучами. Д₂ играет важную роль в обеспечении организма кальцием, прежде всего за счет правильного использования кальция, поступающего с пищей. При недостатке витамина Д₂ в организме происходит нарушение минерализации в процессе костеобразования, что приводит к серьезным изменениям в костном скелете.

Любые заболевания печени независимо от этиологии (действие алкоголя, лекарственных препаратов, промышленных и бытовых токсинов, неправильного питания, вирусных инфекций и т.д.) вызывают повреждение мембран клеток с потерей фосфолипидов, которые являются основными структурными компонентами мембран. Потеря собственных фосфолипидов приводит сначала к инактивации, а затем и к гибели клеток печени. Фосфатидилхолин (лецитин), входящий в состав фосфолипидов, является основным структурным компонентом всех клеточных мембран. При пероральном введении в организм фосфатидилхолин восстанавливает целостность мембран клеток, в первую очередь печени. Фосфатидилхолины используют во многих отраслях промышленности благодаря их прекрасным диспергирующим и эмульгирующим свойствам.

Жирные кислоты имеют широкий спектр применения в парфюмерии, фармакологии, медицине. Наиболее ценными являются полиненасыщенные жирные кислоты. Они должны поступать в организм человека с пищей. При их недостаточности наблюдается отставание в росте, развиваются характерные поражения со стороны кожи и волосяного покрова.

Известны многочисленные способы получения отдельных биологически активных соединений, в частности ликопина, эргостерина, фосфолипидов, жирных кислот с использованием различных микроорганизмов – продуцентов.

Известен способ получения эргостерина из дрожжей (Авт. свид. СССР №465812) [5]. Описан штамм микроскопического гриба Hypomyces rosellus, который используется для получения липидов с высокой степенью ненасыщенности жирных кислот (патент РФ №2020155) [6]. Известен штамм Streptomyces chrostomyceticus, который на минеральной среде накапливает 20-50 мг/кг ликопина (патент Италии №343773) [7]. Описан штамм бактерий Mycobacterium rubrum, который на среде с мелассой и кукурузным экстрактом накапливает до 7,05 мг/г суммарных каротиноидов. При этом в пигментном комплексе бактерий помимо ликопина обнаружены , и -каротин, ауроксантин, лютеин, криптоксантин, виолоксантин, зеаксантин, антераксантин, рубиксантин, лепротеин, неоксантин (А.с. СССР №1071636) [8].

Наиболее активными продуцентами ликопина являются грибы Phycomyces blakesleanus и Blakeslea trispora. У гриба Phycomyces blakesleanus в зависимости от особенностей штамма и условий культивирования уровень накапливания ликопина колеблется в интервале 192-600 мкг/г АСВ [9].

Известны способы получения ликопина из биомассы гриба Blakeslea trispora [10-12]. В соответствии с описанными способами выход кристаллического ликопина составляет 31-56% от количества его в биомассе.

Согласно изобретению, описанному в патенте РФ №2102416, выращивают штаммы гриба Blakeslea trispora А-732-3 (+) и А-731-3 (-) или 8А (+) и 8А (-) на кукурузно-соевой среде с добавлением в качестве стимуляторов ликопинообразования соединений класса аминометилпиридинов или табачной крошки. Выращивание (+) и (-) штаммов ведут в течение 48 часов, полученный посевной материал используют в соотношении 1:9 для последующей ферментации. Получение целевого продукта осуществляют экстракцией подсолнечным маслом, кристаллизацией с использованием этанола и толуола и последующей колоночной хроматографией в системе н-гексан – ацетон 50:1.

В соответствии с описанным способом выход ликопина составляет 0,7 г/л среды. Соотношение ликопина и -каротина составляет 11:1 или 92% и 8% соответственно. К сожалению, в патенте не указан уровень накопления биомассы гриба в единице объема питательной среды, что не дает возможность оценить ликопинсинтезирующую активность культуры – продуцента. Кроме того, для накопления ликопина культурой гриба Blakeslea trispora указанными штаммами в среду добавляют стимуляторы: аминометилпиридин или табачную крошку. При этом табачная крошка является более слабым стимулятором в сравнении с аминометилпиридином, так при ее добавлении в среду культивирования уровень накопления ликопина грибом Blakeslea trispora составляет 0,4 г/л, что в 1,7 раза ниже по сравнению с аминометилпиридином. Добавление в среду культивирования производных пиридина несмотря на их низкие концентрации (0,01-0,005%) нежелательно.

Во всех вышеперечисленных способах получения биологически активных соединений используется, как правило, один конкретный штамм микроорганизма – продуцента того или иного вида соединения.

Наиболее близкими к заявленному изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ликопина, описанный в Евразийском патенте №002468 [13] и способ получения антиоксидантов и биологически активных соединений липидной природы, описанный в Евразийском патенте №003212 [14]. Согласно изобретению [13] ликопин получают при совместном выращивании штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) ВСБ-130(+). Выращивание ведут по 2-стадийной схеме культивирования на минеральной среде с глюкозой или кукурузно-соевой среде.

На минеральной среде с глюкозой на 1-ой стадии выращивают (-) штамм гриба в течение 20 часов, затем на 2-ой стадии в среду культивирования добавляют 3% глюкозы и (+) штамм гриба. Совместное выращивание (+) и (-) штаммов ведут в течение 36 часов. При этом в биомассе накапливается до 35 мг ликопина в пересчете на 1 г абсолютно сухого веса (АСВ) биомассы.

На кукурузно-соевой среде на 1-ой стадии выращивают (-) штамм в течение 32 часов, далее, на 2-ой стадии в среду культивирования вносят (+) штамм гриба. Совместное выращивание ведут в течение 48 часов. При этом в биомассе накапливается до 30 мг ликопина в расчете на 1 г абсолютно сухого веса (АСВ) биомассы.

Экстракцию из биомассы гриба проводят смесью растворителей этанол : гексан в соотношении 4:1 в 3 ступени при температуре 60°С в течение 30 минут на каждую ступень. Соотношение биомассы и растворителя 1:5. Кристаллизацию ликопина ведут в этиловом спирте при температуре 5°С в течение 20 часов. При этом выход ликопина составляет 55% от содержания его в биомассе. Доля основного вещества – 90%.

Согласно изобретению [14] биологически активные соединения липидной природы из биомассы гриба Blakeslea trispora получают экстракцией полярным растворителем (например, ацетоном или этанолом) или смесью полярного и неполярного растворителей (например, ацетон : гексан или этанол : гексан) при температуре 40-70°С в три ступени при соотношении биомасса : экстрагент, равном 1:3,5 на первой ступени, до 1:1,5 на последней. Отделяют полученный экстракт от биошрота путем его горячей фильтрации при 50-60°С. После чего экстракт ставят на кристаллизацию каротиноидов в смеси полярного и неполярного растворителей при 5-20°С в течение 3-24 часов при слабом перемешивании. Выпавшие кристаллы каротиноидов отделяют фильтрованием и промывают этанолом. После отделения кристаллов каротиноидов из раствора липидов выделяют фосфолипиды при температуре 5-20°С в течение 1-5 часов при слабом перемешивании. Кристаллизацию фосфолипидов проводят в ацетоне или смеси ацетона и неполярного растворителя (например, гексана). Полученные фосфолипиды направляются на дальнейшее фракционное разделение в растворе этанола с целью выделения фракции лецитина. Полученный раствор нейтральных липидов омыляют в среде ацетона в водном растворе гидроксида калия при 50-70°С в течение 20-60 минут. Затем омыленную фракцию разбавляют водой и гидролизуют серной кислотой для получения смеси жирных кислот. Неомыленную фракцию упаривают, перерастворяют в гексане и кристаллизуют эргостерин при 0-20°С в течение 4 часов при соотношении гексан : неомыляемая фракция, равном 1:3-1:50, а затем отфильтровывают полученный в процессе кристаллизации эргостерин. Эргостерин на фильтре промывают органическим растворителем или проводят, при необходимости, повторную кристаллизацию. Далее эргостерин счищают с фильтра и высушивают при 60°С.

Задачей данного изобретения является получение новых высокоэффективных штаммов – продуцентов биологически активных соединений, в частности ликопина, эргостерина, фосфолипидов, жирных кислот, разработка более эффективного способа их получения, расширение числа продуцентов, упрощение и удешевление процесса экстракции.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что в результате многоступенчатой селекции и отбора получена пара гриба Blakeslea trispora Б-1(-) и Б-2(+), которая при совместном глубинном культивировании на минеральной среде с глюкозой через 26 часов культивирования накапливает до 40 мг/г АСВ ликопина, на среде с гидролом и кукурузным экстрактом (отходами крахмалопаточного производства) через 30 часов от начала культивирования – до 50 мг/г АСВ ликопина. Содержание ликопина составляет 92-96% от суммы каротиноидов.

Штаммы гриба Б-1(-) и Б-2(+) получены из штаммов гриба Blakeslea trispora ВКПМ F – 414 (-) и ВКПМ F – 414 (+) в результате многоступенчатой селекции с последовательным применением ультрафиолетовых лучей, N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидина и дифениламина в качестве мутагенных факторов и рассевом на чашки Петри с питательной средой сусло-агар (7°Б). Через 18-24 часа выращивания изолированные колонии отсевали в пробирки на скошенный сусло-агар. Отбор колонии производили после 8-10 дневного выращивания их в пробирках при 26°С по признаку наибольшего пигментообразования с последующим определением продуктивности выделенных вариантов. Штаммы Б-1 и Б-2 имеют следующие морфологические характеристики:

Сусло-агар. Штамм Б-2(+) форма. Рост штамма интенсивный. Воздушный мицелий развит слабо. Субстратный мицелий хорошо развит, плотный, желтовато-бежевого цвета. Спорообразование слабое.

Штамм Б-1(-) форма. Рост менее активный по сравнению со штаммом Б-2. Воздушный мицелий отсутствует. Спорообразования на данной среде не обнаруживается. Субстратный мицелий штамма красновато-оранжевого цвета.

При совместном росте на среде сусло-агар в месте соприкосновения (+) и (-) штаммов не образуется характерной полосы черных зигоспор. После соприкосновения с (+) штаммом вся поверхность мицелия (-) штамма окрашивается в бордово-красный цвет.

Штаммы хранятся в коллекции компании ООО «Биосинтез-Мт», авторами штаммов является коллектив авторов Авчиева П.Б., Буторова И.А. и др.

Для получения биомассы с наивысшим содержанием жирорастворимых биологически активных соединений – ликопина, фосфолипидов, жирных кислот и эргостерина процесс культивирования штаммов Blakeslea trispora Б-1(-) и Б-2(+) проводят на специально подобранных питательных средах и режимах выращивания. Питательная среда должна содержать в своем составе легкодоступные источники углерода и азота, а также микроэлементы.

Подготовку посевного материала осуществляют путем раздельного выращивания Б-1(-) и Б-2(+) форм на косяках с сусло-агаром в течение 10 суток при температуре 26-28°С. Далее штаммы раздельно засевают в качалочные колбы со стерильными средами, содержащими в своем составе кукурузную и соевую муку в количестве 1-10% каждого компонента, КН₂PO₄ от 0,01 до 1,00%, тиаминхлорида – 2×10^-5-2×10^-4%, оптимальным значением рН для роста культур является рН 6,0-8,0. На данной среде (-) штамм гриба Blakeslea trispora Б-1 выращивают в течение 60-92 часов при температуре 26-28°С, при оборотах качалки 150-250 об/мин. (+) Штамм гриба выращивают при тех же условиях, но в течение 36-72 часов. Полученная в результате раздельного культивирования биомасса используется в дальнейшем для совместной ферментации Б-2(+) и Б-1(-) штаммов граба Blakeslea trispora. Совместную ферментацию проводят в стерильных условиях на минеральной среде, содержащей легко доступные источники углерода и азота, а также микроэлементы, или на средах, содержащих отходы крахмалопаточного производства (гидрола и кукурузного экстракта), при тех же значениях рН, температуры и оборотах качалки, причем сначала в среду культивирования вносят (-) штамм гриба и только после 12-36 часов от начала культивирования вносят (+) штамм в количестве 0,1-20% (объем.) от первоначально внесенного объема (-) штамма. Совместное культивирование (+) и (-) форм ведут в течение 24-72 часов.

Способы получения биомассы гриба Blakeslea trispora, содержащей в своем составе ликопин, фосфолипиды, жирные кислоты и эргостерин, иллюстрируются в примерах 1 и 2.

Для получения биологически активных соединений (ликопина, эргостерина, фосфолипидов, жирных кислот) биомассу совместно выращенных (+) и (-) штаммов отделяют от культуральной жидкости и высушивают. Экстракцию липидов из биомассы (влажностью 10-15%) проводят любым гидрофобным растворителем при температуре 40-65°С в несколько ступеней при соотношении биомасса : экстрагент от 1:1 до 1:20 (мас.). Наиболее подходящими экстрагентами являются: нефрас, гексан, четыреххлористый углерод, хлороформ. Полученный экстракт отделяют от биошрота путем его горячей фильтрации при 50-60°С.

Кристаллизацию ликопина ведут при 5-20°С в течение 3-24 часов при слабом перемешивании в среде того же органического растворителя, что и процесс экстракции. Данное техническое решение позволяет использовать на первых двух стадиях технологического процесса один и тот же органический растворитель, что приводит к упрощению аппаратурного оформления и снижению затрат на производство целевых продуктов. Выпавшие кристаллы ликопина отделяют фильтрованием. Выход кристаллического ликопина с чистотой 92-96% в результате проведения предлагаемого процесса составляет 70-72% от содержания этого каротиноида в биомассе. После отделения кристаллов ликопина последовательно осуществляют следующие стадии:

– выделение и очистка фосфолипидов;

– выделение и очистка жирных кислот;

– выделение и очистка эргостерина.

Выделение и очистку указанных выше веществ осуществляют методами, предложенными нами ранее [15, 16], которые проиллюстрированы примерами 3 и 4.

Пример 1.

Подготовка посевного материала:

Штаммы гриба Blakeslea trispora Б-1 и Б-2 выращивают на косяках сусло-агар в течение 10 суток. Далее штаммы засевают в качалочные колбы на кукурузно-соевой среде следующего состава:

Выращивание (-) штамма ведут при 26-27°С на качалке при 200 об/мин в течение 72 часов, (+) штамм выращивают в течение 48 часов. Выросшую культуру гриба Б-1(-) использовали как засевной материал для основной ферментации.

Ферментацию ведут на минеральной среде с глюкозой следующего состава:

На минеральной среде (-) штамм гриба Blakeslea trispora Б-1 выращивают 18 часов при 27-28°С. Затем в среду культивирования добавляют предварительно выращенный на кукурузно-соевой среде в течение 48 часов (+) штамм гриба в количестве 1% от объема среды и далее ведут совместное выращивание штаммов в течение 28 часов. Через 26 часов от начала совместного выращивания в биомассе накапливается 40 мг ликопина в расчете на 1 грамм абсолютно сухой биомассы.

Пример 2.

То же, что и в примере 1, но для основной ферментации используют среду на основе отходов крахмалопаточного производства (гидрола и кукурузного экстракта) следующего состава:

На данной среде (-) штамм гриба Blakeslea trispora Б-1 выращивают 20 часов при 27-28°С. Затем в среду культивирования добавляют предварительно выращенный на кукурузно-соевой среде в течение 48 часов (+) штамм гриба в количестве 1% от объема среды и далее ведут совместное выращивание штаммов в течение 30 часов. Через 30 часов от начала совместного выращивания в биомассе накапливается 50 мг ликопина в расчете на 1 грамм абсолютно сухой биомассы.

Пример 3.

Биомассу гриба Blakeslea trispora в количестве 110 г (влажность 10,0%) экстрагируют в три ступени гексаном (соотношение биомасса : экстрагент – 1:6) при 60,0°С. Затем полученные экстракты объединяют. В результате получают 29,7 грамм липидов, имеющих представленный фракционный состав (см. табл.1).

Раствор липидов в гексане охлаждают до +5°С и выдерживают в течение 3 часов при слабом перемешивании, выпавшие кристаллы ликопина отфильтровывают. Полученный ликопин в количестве 2,9 г промывают этиловым спиртом, в результате получают кристаллы с содержанием основного вещества не менее 92-96%. После отделения ликопина из раствора липидов выделяют фосфолипиды при -5°С, для чего к раствору липидов приливают трехкратный объем ацетона. Кристаллизуют фосфолипиды в течение 2,5 часов. В результате процесса получают 6,1 г фосфолипидов. Раствор липидов в ацетоне упаривают, а затем перерастворяют в этаноле и омыляют в 25% водном растворе гидроксида калия при 50°C в течение 20 минут. Омыленную фракцию разбавляют 200 мл воды и гидролизуют H₂SO₄. Полученные жирные кислоты экстрагируют гексаном, в результате получают 4,8 грамм смеси жирных кислот. Неомыленную фракцию экстрагируют гексаном в три ступени по 150 мл на каждой, экстракты объединяют, частично упаривают и кристаллизуют эргостерин при 0°С и соотношении гексан : липиды, равном 1:3. Выпавший в осадок эргостерин фильтруют, промывают и сушат при 60°С, в результате получают 0,9 г эргостерина. Содержание основного вещества в образце эргостерина составляет 85,0%.

Пример 4.

То же, что и в примере 3, но экстракцию биомассы проводят в среде нефраса (t кип. = 70-80°С) при соотношении биомасса : экстрагент, равном 1:3, при температуре 65°С, в четыре ступени, длительностью 40 минут каждая. При охлаждении объединенных экстрактов на фильтре собирают осадок, содержащий комплексную фракцию фосфолипидов и ликопина в количестве 11,8 г. Полученный осадок является конечным продуктом технологии, поскольку значительное содержание фосфолипидов защищает ликопин от окисления, т.е. увеличивает его срок хранения.

Список литературы.

2. Патент ЕП 00544.

3. American Journal of Epidemiology 1999; 149: 168-176.

5. A.с. СССР №465812.

6. Патент РФ №2020155.

7. Патент Италии №343773.

8. А.с. СССР №1071636.

10. Патент РФ 2112747.

11. Патент РФ №2126806.

12. Патент РФ №2102416.

13. Прототип Евразийский патент №002468.

14. Прототип Евразийский патент №003212.

Формула изобретения

Способ получения биологически активных соединений липидной природы, а именно ликопина, фосфолипидов, жирных кислот и эргостерина, путем совместного культивирования двух штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, микроэлементы, с последующим последовательным выделением из биомассы гриба ликопина, фосфолипидов, жирных кислот и эргостерина путем экстракции и кристаллизации, отличающийся тем, что в качестве продуцента биологически активных соединений используют пару штаммов гриба Blakeslea trispora Б-1(-) и Б-2(+), а процессы экстракции ликопина, фосфолипидов, жирных кислот, эргостерина и кристаллизации ликопина ведут в среде одного и того же гидрофобного органического растворителя.

PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

(73) Патентообладатель(и):

Общество с ограниченной ответственностью “Биосинтез Мт”

(73) Патентообладатель:

Общество с ограниченной ответственностью “Здоровье и Красота”

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 19.11.2009 № РД0057055

Извещение опубликовано: 27.12.2009 БИ: 36/2009