Патент на изобретение №2270808

(54) БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД, ПОЧВ И ГРУНТОВ ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к рекультивации и восстановлению почв и грунтов, очистке поверхностных вод с помощью биологически активной композиции. Биологически активная композиция включает ассоциацию нефтеокисляющих бактериальных культур, торф и комплексное минеральное удобрение, стимулирующее рост и развитие нефтеокисляющих бактериальных культур. В качестве ассоциации нефтеокисляющих бактериальных культур содержит Pseudoamycolata halophobica ВСБ-753, Kibdelosporangium aridum ВСБ-754, Acinetobacter oleovorum ВСБ-712, Rhodococcus erytropolis HX7 в объемном соотношении между собой 1:1:1:1, при следующем соотношении компонентов, мас.%: ассоциация нефтеокисляющих бактериальных культур – 1-3; комплексное минеральное удобрение, стимулирующее рост и развитие нефтеокисляющей бактериальной культуры, – 7-9; торф – остальное. Изобретение позволяет очистить почвы и воды от нефти в условиях низких положительных температур с большой эффективностью. 1 табл.

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к рекультивации и восстановлению почв и грунтов, очистке поверхностных вод, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, и может быть использовано в нефтехимической, нефтеперерабатывающей, микробиологической, пищевой, фармацевтической промышленностях с целью очистки почв, грунтов, сточных вод, содержащих промежуточные продукты окисления, различных поверхностей и емкостей. В настоящее время в биотехнологии широко используются микроорганизмы различных таксономических групп, окисляющих широкий спектр углеводородов.

Известен способ очистки почв и водоемов от нефтяных загрязнений, заключающийся в обработке загрязненной поверхности водной суспензией бактериальной культуры природного штамма Pseudomonas putida-36 в смеси с минеральным удобрением – нитроаммофоской. Способ обеспечивает высокое качество очистки – до 90% по истечении 2 месяцев после обработки, но не эффективен при температурах 6-13°С (А.С. №1428809, БИ №37 1988, Е 02 В 15/04).

Известен биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов, включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии: Mycobacterium flavescens ВКПМ В-6000, Mycobacterium sp. ИЖ-4б, Rhodococcus sp. 56Д и Acinetobacter sp. HB-1 в концентрации 1,2-5,0×10⁷ кл/мл препарата, отличающийся тем, что он дополнительно содержит нефть, сахарозу и полиэтиленгликоль при следующем соотношении, мас.%: нефть – 0,5-1, сахароза – 1-5, полиэтиленгликоль – 1-5, остальное – вода (патент RU №2191752, БИ №30, 2002, С 02 F 3/34). Недостатком этого препарата является использование трех неидентифицированных культур, дорогого углеводного источника – сахарозы, отсутствие данных по степени очистки.

Известен способ очистки почвы и водоемов от нефтяных загрязнений, включающий обработку поверхности смесью микроорганизмов и питательных веществ, отличающийся тем, что в качестве смеси микроорганизмов и питательных веществ используют сухой активный ил целлюлозно-бумажных предприятий (патент RU №2198748, БИ №5, 20.02.2003, 7 B 09 С 1/10, С 02 F 3/34, С 12 N 1/20). Недостатком способа является нестабильность активного ила очистных сооружений различных предприятий.

Также известен способ очистки почвы от загрязнения нефтью и нефтепродуктами, заключающийся в том, что в загрязненные участки вводят торф, который предварительно активируют введением минеральных добавок и последующей инкубацией в мезофильном режиме в течение 3-7 суток для увеличения в нем численности углеводородокисляющих микроорганизмов (патент RU №2137559, С1, 20.09.99).

Наиболее близким из числа технических решений является способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефтезагрязнений, включающий культивирование нефтеокисляющих бактерий на питательной среде, внесение их в стерильный торф, добавление раствора минеральных солей и дополнительное поверхностное культивирование нефтеокисляющих бактерий на торфе в течение 5-7 суток (патент RU №2116145, С1, 27.07.98).

Недостатками двух последних аналоговых биопрепаратов является необходимость дополнительной длительной операции культивирования нефтеокисляющих культур на торфе в течение 3-7 дней при 22-30°С. Эта операция повышает трудоемкость технологического процесса получения биопрепаратов.

Также существенным недостатком аналоговых биопрепаратов является невысокая эффективность очистки при использовании их в районах с холодным климатом.

Целью изобретения является ускорение биодеградации различных классов нефтяных углеводородов при низких температурах.

Эта цель достигается путем создания биологически активной композиции, состоящей из нефтеокисляющих бактериальных культур, комплексного минерального удобрения и торфа, которая обеспечивает очистку поверхностных вод, почв и грунтов от нефтяных загрязнений и загрязнений полициклическими ароматическими углеводородами с высокой эффективностью, низкими затратами и экологически безопасным способом в широком интервале температур от 6°С до 25°С.

Биологически активная композиция содержит в качестве нефтеокисляющих бактериальных культур четыре штамма: Rhodococcus erythropolis HX7 (патент RU №2039714), Acinetobacter oleovorum ВСБ-712 (патент RU №1809822, БИ №14, 1993), Pseudoamycolata halophobica БСБ-753 и Kibdelosporangium aridum БСБ-754.

В качестве комплексного минерального удобрения используют гранулированное удобрение, содержащее, мас.%, не менее: NH₄-N – 8,6; NO₃-N – 4,4; P₂O₅ – 7,7; К₂О – 17,0; MgO – 0,8; Mn – 0,16; Cu – 0,08; В – 0,09; Fe – 0,16; Zn – 0,09; Со – 0,008 (ТУ 2387-004-40300350-99). Это удобрение используется как источник питания для нефтеокисляющих бактериальных культур и стимулятор процессов деструкции нефтяных углеводородов.

В качестве носителя для нефтеокисляющих микроорганизмов и структуратора очищаемой почвы используется торф для приготовления компостов, выпускаемый в соответствии с ГОСТ Р 51661.1-2000.

В нефтезагрязненные почвы, грунты вносится биологически активная композиция в количестве 30-70 г (в зависимости от степени загрязненности) на 1 кг нефтезагрязненной почвы; в нефтезагрязненные воды в количестве 5 г на 1 литр.

Композиция обеспечивает одновременно сорбцию нефтяных углеводородов и является носителем и источником расселения нефтеокисляющих бактериальных культур ассоциации, обеспечивающих высокую скорость деструкции углеводородов нефти, и может применяться в северных регионах страны при 6-15°С.

Характеристика штамма Rhodococcus erythropolis HX7:

Штамм HX7 выделен из образцов почвы, отобранных в тундре на севере Архангельской области вблизи нефтяных скважин. На основании генетических исследований 16-s рибосомальной РНК идентифицирован как Rhodococcus erythropolis.

Культурально-морфологические признаки. Клетки штамма НХ7 неподвижные, грамположительные, некислотоустойчивые, спор не образуют. При росте бактерии имеют выраженный цикл развития (палочки, кокки). Деление осуществляется, в основном, по раскалывающемуся типу, в растущих культурах доминируют V-формы. При росте на среде МПА, сусло-агаре образуют кремовые или телесные с розовым оттенком колонии, на среде Гаузе – розовые колонии.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб, растет при температуре 3-30°С при рН 4,5-11. В клеточной стенке содержится мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза (1V тип клеточной стенки). Штамм каталаза положительный и оксидаза отрицательный; желатин не разжижает, молоко не пентонизирует. В качестве источников азота использует соединения аммония и нитраты. Образует кислоту из следующих углеводов: глюкозы, арабинозы, салицина, лактозы, галактозы. В качестве единственного источника углерода использует глюкозу, сахарозу. Штамм способен использовать для роста сырую нефть и различные фракции нефти: н-алканов, ароматических углеводородов. А также различные продукты переработки нефти: дизельное, реактивное топлива, мазуты. Штамм способен расти в средах, содержащих до 90% нефти.

Штамм не патогенен, не обладает вирулентными и токсигенными свойствами, не диссеминирует во внутренних органах лабораторных животных, не обладает иммуногенным и аллергенным действием.

Клетки штамма НХ7 хорошо сохраняют жизнеспособность и нефтеокисляющую активность при -20°С в 30%-ном растворе глицерина в течение года. Клетки также хорошо сохраняются в лиофилизованном состоянии в течение 3 лет.

Штамм Rhodococcus erythropolis HX7 депонирован под номером ВКПМ S -1267 в Российской коллекции промышленных микроорганизмов.

Характеристика новых культур:

Штамм БСБ-753 выделен из воды р. Двины на средах с углеводородами различного фракционного состава и идентифицирован как Pseudoamycolata halophobica.

Культурально-морфологические признаки. Pseudoamycolata halophobica штамм ВСБ-753 – грамположительные подвижные палочки неправильной формы, расположенные под углом друг к другу, размер клеток 0,3×2 мкм, встречаются одиночные клетки размером до 0,7-1,0-2,5-8,0 мкм. Формируют светло-оранжевые вегетативные ветвящиеся гифы, распадающиеся на палочковидные и овальные элементы. На воздушных гифах образуются короткие цепочки спор. Наблюдаются набухшие сегменты гиф (около 3 мкм длиной) с поперечными и продольными септами. Клеточная стенка 1V типа (арабиноза) На ГРМ-агаре растут в виде серо-кремовых слизистых колоний с четко очерченным краем, на минимальной синтетической питательной среде колонии приобретают неправильную форму с выростами, напоминающими мицелиальные элементы. На МПА мелкие колонии размером 1,0-1,5 мм, центр возвышен, край ровный, поверхность матовая кремовая. На агаре Хотингера колонии мелкие 0,6-1,0 мм, к центру небольшое возвышение, поверхность матовая, край ровный.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб, каталазоположительный, желатину разжижает слабо, окисляет маннозу и фруктозу, молоко не сворачивает и не пептонизирует. Нитраты не восстанавливает. В МПБ умеренная муть, кольцо, осадок на дне рыхлый, индол и сероводород не образуют. Штамм хорошо растет в широком интервале температур культивирования 6, 10, 18 и 25°С. Штамм не токсичен и не патогенен.

Чувствительность к антибиотикам изучена с использованием бумажных дисков, содержащих стандартные концентрации ампициллина, карбенициллина, оксациллина, стрептомицина, канамицина, левомицетина, рафампицина, тетрациклина, эритромицина, фузидина. Данные представлены в таблице 1.

Штамм Pseudoamycolata halophobica ВСБ – 753 хранится в музее коллекции микроорганизмов ООО ПКФ “БИГОР”.

Штамм ВСБ-754 выделен из воды р.Печоры на средах с углеводородами различного фракционного состава и идентифицирован как Kibdelosporangium aridum.

Культурально-морфологические признаки. Kibdelosporangium aridum штамм ВСБ-754 – грамположительные подвижные палочки размером 0,5-1,0×2,0×7,0 мкм, неправильной формы, расположенные поодиночке или в коротких цепочках со светло-оранжевым внутриклеточным пигментом. На воздушном мицелии образуются цепочки парных, почти округлых спор и умеренно часто спорангиоподобные структуры диаметром 10-15 мкм грушевидной формы. Клеточная стенка 1V типа. Гидролизаты целых клеток содержат арабинозу, рамноза не обнаружена. На ГРМ-агаре растут в виде серо-кремовых гладко-слизистых колоний с четко очерченным краем. На МПА – мелкие (0,8-1,0 мм) колонии, к центру возвышаются равномерно, край слабо извилистый, поверхность блестящая. На агаре Хотингера колонии мелкие 0,8-1,5 мм, к центру небольшое возвышение, поверхность слабо матовая, край извилистый. На богатой среде с кровью растут более скудно, образуя выраженные слизистые колонии. Гемолиз эритроцитов не вызывают.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб, некислотоустойчив, каталазоположительный, желатину разжижает слабо на 21 день, молоко пептонизирует, нитраты восстанавливает. На ломтике картофеля рост хороший, поверхность блестящая, край извилистый, светло-розового цвета. В МПБ на дне образует рыхлый осадок, слабое помутнение, кольцо, пигмента нет. Ассимилирует 1-арабинозу, декстрин, рафинозу. Индол, сероводород не образуют. Штамм хорошо растет в широком интервале температур культивирования 6, 10, 18 и 25°С, рН среды 6,5-7,2. Штамм не токсичен и не патогенен.

Штамм Kibdelosporangium aridum ВСБ-754 хранится в музее коллекции микроорганизмов ООО ПКФ “БИГОР”.

Использование новых культур Pseudoamycolata halophobica ВСБ-753 и Kibdelosporangium aridum ВСБ-754 совместно с Rhodococcus erythropolis HX7 и Acinetobacter oleovorum ВСБ-712 и с комплексным минеральным удобрением позволяет повысить эффективность разложения нефтяных углеводородов широкого диапазона (от легких до тяжелых нефтепродуктов, полиароматических соединений) и обеспечить высокую степень очистки почв при низких положительных температурах при равном соотношении всех культур.

Приготовление биологически активной композиции:

Для получения биомассы культур их выращивают на жидкой минеральной среде следующего состава (г/л): KNO₃ – 4; КН₂PO₄ – 0,6; Na₂HPO₄ – 1,4; MgSO₄ – 0,8; FeSO₄ – 0,015; среды рН – 6,8-7,0. В качестве источника углерода используют 0,5-1,0% “Парекс” (содержание н-алканов C₈-C₁₉) в течение 48 часов при температуре 17°С. Иммобилизация клеток на торфе осуществляется обработкой водной суспензией с концентрацией клеток 1,2-1,5 ед. оптической плотности при объемном соотношении водной суспензии и торфа (1:2). Количество иммобилизованных нефтеокисляющих клеток достигает 10⁷-10⁹ кл/г. Затем в торф вносят комплексное минеральное удобрение в концентрации 7-9% масс.; нефтеокисляющие бактериальные культуры составят 1-3% массы биологически активной композиции.

При внесении биологически активной композиции в иммобилизованной на торфе форме в загрязненную почву происходит адсорбция жидких нефтепродуктов на торфе. Иммобилизованные на торфе нефтеокисляющие бактериальные культуры начинают активно расти и размножаться в данной среде за счет использования нефтяных углеводородов в качестве источника углерода и энергии и минеральных солей комплексного удобрения.

Способ внесения биологически активной композиции в нефтезагрязненные участки осуществляется следующим образом.

Обработку нефтезагрязненных участков (водоемы, почвы, нефтезагрязненные участки промзон) проводят в весенне-летний или осенний период при среднесуточных температурах почвы не ниже +3°С. В почвы и грунты биологически активная композиция вносится методом вспашки или перемешиванием в количестве 30-70 г (в зависимости от уровня загрязнения) на 1 кг нефтезагрязненной почвы. Если почвы сухие – осуществляется их предварительный полив. Кроме того, в течение очистки рекомендуется проводить дополнительные агротехнические мероприятия – рыхление и полив очищаемых участков. Для очистки нефтезагрязненных вод биологически активная композиция используется в концентрациях 5 г на 1 литр. В процессе очистки через 2-4 недели проводят дополнительные подкормки раствором минерального комплексного удобрения. Количество вносимого минерального комплексного удобрения варьируется в зависимости от степени загрязнения от 0,15 до 1,5 мас.%. Через месяц после проведения обработок и далее до окончания процессов очистки каждый месяц проводят химический анализ почвы (воды). Об эффективности очистки судят по уменьшению концентрации нефтяных углеводородов в пробах почвы (воды).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Использование биологически активной композиции для очистки от светлых нефтепродуктов.

Ассоциацию углеводородокисляющих культур Pseudoamycolata halophobica ВСБ-753, Kibdelosporangium aridum ВСБ-754, Rhodococcus erythropolis HX7 и Acinetobacter oleovorum ВСБ-712 выращивали в аэробных условиях в качалочных колбах.

Очистка осуществляется в жидкой среде следующего состава г/л: KNO₃ – 4; KH₂PO₄ – 0,6; Na₂HPO₄ – 1,4; MgSO₄ – 0,8; FeSO₄ – 0,015; рН – 6,8-7,0. В качестве единственного источника углерода использовали зимнее дизельное топливо фракции 280-340°С (ГОСТ 305-82). Концентрация дизельного топлива в среде 1 об.%, количество вносимой композиции – 1 г/200 мл среды. Время очистки – 6 суток на качалке при 180 об/мин; температура 7-10°С. Утилизация нефтяных углеводородов за это время составила – 85%.

Пример 2. Использование биологически активной композиции для очистки от сырой нефти.

Условия очистки такие же, как в п.1, в качестве единственного источника углерода использовали сырую нефть в концентрации 0,5%. Время очистки – 6 суток. Ассоциация обеспечивает утилизацию сырой нефти на 69%.

Пример 3. Использование биологически активной композиции для очистки от мазута.

В аэробных условиях выращивали вышеперечисленную ассоциацию культур в качалочных колбах.

Условия очистки как в примере 1. В качестве единственного источника углерода использовали флотский мазут марки Ф-5 (ГОСТ 10585-99), содержащий (%): н-алканов до 11, нафтено-изоалканов до 51,8; ароматических углеводородов до 30,1; смолисто-асфальтеновых веществ до 7,1. Время очистки 6 суток на качалке с 180 об/мин при 17-18°С. Утилизация нефтяных углеводородов составила 52%.

Пример 4. В загрязненную дизельным топливом (фракция 280-340°С (ГОСТ 305-82)) почву (концентрация 110 г/кг почвы) вносится биологически активная композиция из четырех перечисленных культур в концентрациях: 1 вариант – 4 г на 1 кг загрязненной почвы; 2 вариант – 40 г на 1 кг загрязненной почвы с клеточным титром 10⁷-10⁸ кл/г биопрепарата. Образуемый компост перемешивается и увлажняется. Очистка происходит при 10-12°С. Через 2 недели в почву дополнительно вносится 1% раствор комплексного минерального удобрения. Через 4 недели концентрация нефтепродуктов в очищаемой почве уменьшилась в варианте 1 – на 12%; в варианте 2 – на 25% по отношению к контрольному варианту, в который композицию не вносили, перемешали и увлажняли как опытные варианты.

Пример 5. В загрязненную флотским мазутом (марка Ф-5) почву (концентрация 180 г/кг) вносится биологически активная композиция из четырех перечисленных культур в концентрации: 1 вариант – 6,5 г на 1 кг загрязненной почвы; 2 вариант – 65 г на 1 кг загрязненной почвы с клеточным титром 10⁷-10⁸ кл/г биопрепарата. Образуемый компост перемешивается, увлажняется и вносится дополнительное минеральное питание, как в примере 4. Очистка происходит при 16-17°С. Через 4 недели содержание нефтяных углеводородов в очищаемой почве снижается в первом варианте на 15%, во 2 варианте на 31% по отношению к контрольному варианту без внесения композиции.

Пример 6. В загрязненную сырой нефтью (концентрация 100 г/кг) почву вносили биологически активную композицию из четырех перечисленных культур в концентрации: 1 вариант – 3,4 г на 1 кг загрязненной почвы; 2 вариант – 34 г на 1 кг загрязненной почвы с клеточным титром 10⁷-10⁸ кл/г биопрепарата. Образуемый компост перемешивается, увлажняется и вносится дополнительное минеральное питание, как в примере 4. Через 1 месяц содержание нефтяных углеводородов в очищаемой почве снижается в первом варианте на 20%; во втором – на 32%.

Таким образом, предлагаемый способ может быть использован для очистки почвы и воды от нефти, светлых и темных тяжелых нефтепродуктов с загрязненностью до 20% в условиях низких положительных температур с большой эффективностью.

Источники, принятые во внимание:

1. А.С. СССР №1428809, БИ №37, 1988, Е 02 В 15/04.

2. Патент RU №2137559 С1, 20.09.99.

3. Патент RU №2116145 C1, 27.07.98.

Формула изобретения

Биологически активная композиция для очистки поверхностных вод, почв и грунтов от нефтезагрязнений, включающая ассоциацию нефтеокисляющих бактериальных культур, торф и комплексное минеральное удобрение, стимулирующее рост и развитие нефтеокисляющих бактериальных культур, отличающаяся тем, что она в качестве ассоциации нефтеокисляющих бактериальных культур содержит Pseudoamycolata halophobica ВСБ – 753, Kibdelosporangium aridum ВСБ-754, Acinetobacter oleovorum ВСБ-712, Rhodococcus erythropolis HX7 в объемном соотношении между собой 1:1:1:1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 31.05.2006

Извещение опубликовано: 20.08.2007 БИ: 23/2007