Патент на изобретение №2270449
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАТЕКСНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ЛАТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИИ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу получения латексного диагностикума инфекционных заболеваний рогатого скота и птиц. Способ получения латексного диагностикума заключается в том, что полимерную суспензию центрифугируют, доводят дистиллированной водой концентрацию полимерной суспензии до 0,5% по сухому остатку полимера, смешивают в равных объемах водные растворы вирусного антигена в инфекционном титре 6,5 lg ТЦД/50 мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5%-1,0%-ную полимерную суспензию, помещают в термостат при +36-38°С на 4-6 час. Затем к общему объему суспензии добавляют водный раствор человеческого сывороточного альбумина в концентрации 0,07-0,15%, инкубируют при +4-8°С в течение 11-13 часов, суспензию отмывают и доводят концентрацию диагностикума фосфатно-солевым буфером рН 7,2-7,4 до 0,1-0,3%. Приготовленный диагностикум хранится при 4°С до года. Диагностикум позволяет своевременно распознавать конкретные инфекционные заболевания и принять соответствующие своевременные меры лечения и профилактики. 7 табл.
Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности способу получения латексного диагностикума инфекционных заболеваний рогатого скота и птиц. Этиология многих инфекционных болезней рогатого скота и птиц включает широкий круг возбудителей. Среди них важное эпизоотологическое значение имеет аденовирусная инфекция, вирусная диарея, респираторно-синцитиальная, инфекционный ринотрахеит, парагрипп-3, оспа и болезнь Ньюкасла птиц. Часто эти вирусы действуют в ассоциациях. Немало важным является то, что вирусная инфекция очень часто осложняются секундарной микрофлорой. Все эти обстоятельства приводят к значительному экономическому ущербу, который складывается из потери продуктивности, рождении нежизнеспособного потомства, вынужденного убоя, гибели животных. В настоящее время известен способ приготовления лептоспирозного диагностикума для постановки реакции латекс-агглютинации, включающий использование карбоксилированных частиц, активированных карбодиимидом, к поверхности которых иммобилизируют IgG-антитела к лептоспирам серогрупп Canicola и Icterohaemorhagiae с ультразвуковой обработкой и инкубацией, отмывкой дистиллированной водой, центрифугированием и добавлением физиологического раствора до первоначального объема [1]. Известен также способ получения латексного диагностикума включающий сенсибилизацию антиглобулиновыми сыворотками к различным заболеваниям на частицы полиакрилового латекса с последующим выдерживанием в течение 4 час при комнатной температуре при рН 7,0-7,4 и 12 час при 4°С при постоянном равномерном перемешивании [2] – прототип. В задачу наших исследований входило – получение высокочувствительного специфичного латексного диагностикума для постановки реакции латекс-агглютинации (РЛА), к таким заболеваниям, как аденовирусная инфекция, вирусная диарея, респираторно-синцитиальная инфекция, инфекционный ринотрахеит, парагрипп-3 рогатого скота, оспа и Нъюкасла птиц. Предлагаемый нами способ получения латексного диагностикума заключается в следующем: – полимерную суспензию центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин и бидистиллятом доводят концентрацию полимерной суспензии до 0,5%-1,0% (по сухому остатку полимера). Смешивали в равных объемах водные растворы вирусного антигена в инфекционном титре 6,5 lg-7,0 Ig ТЦД/50 мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5%-1,0%-ную полимерную суспензию, помещали в термостат при +36+38°С на 4-6 час (процесс инкубации). Через 4-6 час к общему объему суспензии добавляли 0,5 части водного раствора человеческого сывороточного альбумина в концентрации 0,07-015% и выдерживали в термостате при +4-8°С еще в течение 11-13 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (антиген, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,2-7,4) до 0,1-0,3%. Приготовленный диагностикум может сохраняли при 4°С до одного года. Диагностикум используют в постановке реакции латекс-агглютинации по стандартной методике. Примеры. Пример 1. Полимерную суспензию центрифугировали 15 мин при 4000 об/мин и бидистиллятом доводили концентрацию полимерной суспензии до 0,5% (по сухому остатку полимера). Смешивали равные объемы водные растворы аденовирусного антигена в инфекционном титре 6,5 lg ТЦД/50 мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5%-ную сывороточного альбумина в концентрации 0,07% и выдерживали в термостате при +4°С еще в течение 11 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (аденовирусный антиген, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) до 0,1%. Диагностикум используют в постановке реакции латекс-агглютинации (РЛА) по стандартной методике. Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевших животных, содержащие антитела к аденовирусной инфекции, и сыворотки крови к вирусам инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, респираторно-синцитиальному вирусу, парагриппа-3 крупного рогатого скота (КРС) и к вирусам оспы и Нъюкасла птиц, и сыворотку крови, не содержащую антител к данным инфекциям.
Как видно из табл.1, диагностикум на аденовирусную инфекцию оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования, как РН, РНГА, что свидетельствует о перспективности патентуемого изобретения Пример 2. Диагностикум готовили, как в примере 1, но брали в качестве биолиганда вирус инфекционного ринотрахеита рогатого скота, смешивали в равных объемах водные растворы инфекционного ринотрахеита в титре 7.0 lg ТЦД50/мл и 0,6%-ую полимерную суспензию и помещали в термостат при +37°С на 5 часов в водной среде, периодически перемешивая (процесс инкубации). Через 5 часов к общему объему суспензии добавляли 0,5 части водного раствора человеческого сывороточного альбумина в концентрации 0,08% и выдерживали в термостате при +4°С еще в течение 12 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин, от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (вирус инфекционного ринотрахеита, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,3) до 0,2%. Диагностикум используют в постановке реакции латекс-агглютинации (РЛА) по стандартной методике. Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевших животных, содержащих антитела к вирусу инфекционного ринотрахеита, сыворотки крови к вирусам адено-, вирусной диареи, респираторно-синцитиальному вирусу, парагриппа-3 крупного рогатого скота (КРС) и к вирусам оспы и Нъюкасла птиц, и сыворотку крови, не содержащую антител к данным инфекциям.
Как видно из табл.2, диагностикум на инфекционный ринотрахеит оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования, как РН, РНГА, что свидетельствует о перспективности патентуемого изобретения. Пример 3. Диагностикум готовили, как в примере 1, но в качестве биолиганда брали респираторно-синцитиальнный вирус. Смешивают в равных объемах водные растворы респираторно-синцитиальный вирус в инфекционном титре 6,5 lg ТЦД50/мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5%-ную полимерную в суспензию, помещают в термостат при +38°С на 6 час в водной среде, периодически перемешивая (процесс инкубации). Через 4 час к общему объему суспензии добавляют 0,5 части водного раствора человеческого сывороточного альбумина в концентрации 0,09% и выдерживают в термостате при +4°С еще в течение 13 часов. После инкубации бидистиллятом отмывают суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин, от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (аденовирусный антиген, альбумин) и концентрацию суспензии доводят фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) до 0,1%. Диагностикум использовали в постановке реакции латекс-агглютинации (РЛА) Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевших животных, содержащих антитела к вирусу респираторно-синцитиальному инфекционного ринотрахеита, сыворотки крови к вирусам адено-, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, парагриппа-3 крупного рогатого скота (КРС) и к вирусам оспы и Нъюкасла птиц, и сыворотку крови, не содержащую антител к данным инфекциям.
Как видно из табл.3, диагностикум на респираторно-синцитиальную инфекцию оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования, как РН, РНГА, что свидетельствовало о перспективности патентуемого изобретения. Пример 4. Диагностикум готовили, как в примере 1, но в качестве биолиганда брали вирус вирусной диареи. Смешивали в равных объемах водные растворы вируса вирусной диареи с инфекционном титре 6,5 lg ТЦД50/мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5%-ную полимерную в суспензию, помещают в термостат при +37°С на 4 час в водной среде, периодически перемешивая (процесс инкубации). Через 4 час к общему объему суспензии добавляют 0,5 части водного раствора человеческого сывороточного альбумина в концентрации 0,1% и выдерживают в термостате при +4°С еще в течение 11 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (вирус вирусной диареи, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) до 0,1% концентрации. Диагностикум использовали в постановке реакции латекс-агглютинации (РЛА) Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевших животных, содержащих антитела к вирусу вирусной диареи, сывороток крови к вирусам инфекционного ринотрахеита, адено-, вирусной диареи, респираторно-синцитиальному вирусу, парагриппа-3 крупного рогатого скота (КРС) и к вирусам оспы и Нъюкасла птиц, и сыворотку крови, не содержащую антител к данным инфекциям.
Как видно из табл.4, диагностикум на вирусную диарею оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования, как РН, РНГА, что свидетельствовало о перспективности патентуемого изобретения. Пример 5. Диагностикум готовили, как в примере 1, но в качестве биолиганда брали вирус парагриппа-3 рогатого скота. Смешивали равные объемы водные растворы вируса парагриппа в инфекционном титре 6,5 lg ТЦД/50мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 1,0%-ную сывороточного альбумина в концентрации 0,15% и выдерживали в термостате при +4°С еще в течение 13 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин от неиммобилизированных на поверхности частиц биолигандов (вируса парагриппа-3, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) до концентрации 0,2%. Диагностикум использовали в постановке реакции латекс-агглютинации (РЛА). Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевших животных, содержащих антитела к вирусу парагриппа-3, сыворотки крови к вирусам инфекционного ринотрахеита, адено-, вирусной диареи, респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота (КРС) и к вирусам оспы и Нъюкасла птиц, и сыворотку крови, не содержащую антител к данным инфекциям.
Как видно из табл.5, диагностикум на парагрипп-3 оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования, как РН, РНГА, что свидетельствует о перспективности патентуемого изобретения. Пример 6. Диагностикум готовили, как в примере 1, но брали в качестве биолиганда вирус оспы птиц. Смешивали в равных объемах водные растворы вируса оспы птиц в инфекционном титре 6,5 lg ТЦД/50мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5%-ную сывороточного альбумина в концентрации 0,07% и выдерживали в термостате при +4°С еще в течение 11 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (вируса оспы птиц, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) до 0,2% концентрации. Диагностикум использовали в постановке реакции латекс-агглютинации (РЛА) по стандартной методике. Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевшей птицы, содержащих антитела к вирусу оспы птиц, инфекционного ринотрахеита, сыворотки крови к вирусам инфекционного ринотрахеита, адено- и вирусной диареи, респираторно-синцитиальному вирусу, парагриппа-3 крупного рогатого скота (КРС), Нъюкасла птиц, и сыворотку крови, не содержавшую антител к данным инфекциям.
Как видно из табл.6, диагностикум на вирус оспы птиц оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования, как РН, РДП, что свидетельствует о перспективности патентуемого изобретения. Пример 7. Диагностикум готовили как в примере 1, но брали в качестве биолиганда вирус Нъюкасла птиц. Смешивали в равных объемах водные растворы вируса Нъюкасла в инфекционном титре 6,5 lg ТЦД/50мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,6%-ную сывороточного альбумина в концентрации 0,08% и выдерживали в термостате при +4°С еще в течение 11 часов. После инкубации бидистиллятом отмывали суспензию на центрифуге три раза по 15 минут при 4000 об/мин от неиммобилизированных на поверхность частиц биолигандов (вирус Нъюкасла птиц, альбумин) и концентрацию суспензии доводили фосфатно-солевым буфером (рН 7,3) до 0,3% концентрации. Диагностикум использовали в постановке реакции латекс- агглютинации (РЛА) по стандартной методике. Для постановки РЛА использовали 10 сывороток крови переболевших птиц, содержащих антитела к вирусу Нъюкасла птиц, инфекционного ринотрахеита, сыворотки крови к вирусам инфекционного ринотрахеита, адено-, вирусной диареи, респираторно-синцитиальному вирусу, парагриппа-3 крупного рогатого скота (КРС), и к вирусам оспы птиц, и сыворотку крови, не содержащим антител к данным инфекциям.
Как видно из табл.7, диагностикум к вирусу Нъюкасла птиц оказался чувствительным и специфичным. Степень его чувствительности была сопоставима с такими методами исследования как РН, РНГА, что свидетельствовало о перспективности патентуемого изобретения. Как видно из примеров, предложенный способ обеспечивает получение высокочувствительного и специфичного латексного диагностикума для дифференциации различных инфекционных заболеваний рогатого скота и птиц. Диагностикум, полученный предложенным способом, апробирован положительным результатом в Федеральном Государственном Учреждении Центральной Научно-методической ветеринарной лаборатории РФ (ФГУЦНМВЛ), Московской Государственной Академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина (МГАВМиБ) в 2003-2004 гг. Диагностикум полученный предложенным способом найдет применение в НИИ ветеринарного профиля, в диагностических ветеринарных лабораториях РФ и позволит своевременно распознавать конкретные инфекционные заболевания и принять соответствующие своевременные меры лечения и профилактики. Источники информации 1. Патент РФ. 2177617, Кл. G 01 N 33/567 (2001). 2. Патент РФ. 2012888, Кл. G 01 N 33/531 (1994).
Формула изобретения
Способ получения латексного диагностикума для постановки реакции латекс-агглютинации путем иммобилизации полимерных микросфер вирусными антигенами и получения готового диагностикума, отличающийся тем, что в качестве полимерных микросфер берут окрашенные полимерные микросферы в концентрации 0,5-1,0% по сухому остатку полимера с диаметром частиц 1,5 мкм, представляющего собой сополимер стирола, акролеина, стиролсульфоната натрия, иммобилизацию проводят в водной среде в течение 4-6 ч при температуре +36÷38°С, периодически перемешивая, далее добавляют 0,07-0,15%-ный водный раствор человеческого альбумина, выдерживают в течение 11-13 ч при температуре +4÷8°С, отмывают трехкратным центрифугированием по 15 мин при 4000 об/мин несвязавшиеся биолиганды 0,15 М фосфатно-солевым буфером рН 7,2-7,4, полученный диагностикум доводят до концентрации 0,1-0,3% по сухому остатку полимера.
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 16.07.2006
Извещение опубликовано: 20.08.2007 БИ: 23/2007
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
