Патент на изобретение №2270252

(54) НАБОР ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ РОДА ORTHOPOXVIRUS, БИОЛОГИЧЕСКИЙ МИКРОЧИП, НАБОР И СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ РОДА ORTHOPOXVIRUS

(57) Реферат:

Изобретение относится к области вирусологии и молекулярной биологии. Предложен способ видовой идентификации вирусов рода Orthopoxvirus. Способ включает двухстадийную ПЦР с получением одноцепочечного флуоресцентно меченого фрагмента ДНК, гибридизацию на микрочипе, содержащем набор дифференцирующих олигонуклеотидов, регистрацию и интерпретацию результатов. При этом результат оценивают путем сравнения результата проведения способа с набором стандартных, индивидуальных для каждого вида, шаблонов, подобранных таким образом, что флуоресцентный сигнал совершенного дуплекса позволяет однозначно провести видовую идентификацию вирусов рода Orthopoxvirus. Предложены также набор дифференцирующих олигонуклеотидов, биологический микрочип и набор для проведения такого способа. Предложенная группа изобретений позволяет ускорить проведение анализа и повысить его точность. Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии и вирусологии. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

Область техники

Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии, конкретно к видовой идентификации вирусов рода Orthopoxvirus, включающей этап гибридизации специально подготовленной вирусной ДНК на биологическом микрочипе. Изобретение также раскрывает конструирование высокоспецифичных ДНК-зондов, дифференцирующих виды ортопоксвирусов по последовательности гена crmB.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время для видовой идентификации ортопоксвирусов применяются следующие методы:

I. Обнаружение оспенного антигена методом иммунофлуоресценции [1, 2];

II. Иммунная электронная микроскопия [3, 4];

III. Выделение на куриных эмбрионах [5, 6];

IV. Иммуноферментный анализ в применении к видовой идентификации ортопоксвирусов [2, 7];

V. Реакция непрямой гемагглютинации [8];

VI. Методы, основанные на ПЦР:

a) с последующим анализом длины амплифипированного фрагмента [9];

b) с последующим рестрикционным анализом [9, 10].

Эффективность метода иммунофлуоресценции зависит от вида исследуемого материала. Достоверность результатов исследования материалов из пустул и корок невелика из-за примеси лейкоцитов, обладающих аутофлуоресценцией.

Методы (II, IV) требуют наличия видоспецифичных моноклональных антител для каждого вида ортопоксвирусов. Возможность применения методов на данный момент показана лишь на весьма ограниченном количестве ортопоксвирусов. К тому же, применение методов (I, II, IV) для видовой диагностики ограничено ввиду близкого антигенного родства представителей Orthopoxvirus.

Выделение на куриных эмбрионах (III), являясь по сути культуральным методом, требует наличия специального оборудования и высококвалифицированного персонала. Анализ занимает несколько дней и связан с повышенной биологической опасностью. Кроме того, метод весьма чувствителен к качеству и возрасту используемых куриных эмбрионов и часто вызывает трудности интерпретации полученных результатов.

Метод (V) требует не только наличия моноклинальных антител, но и использования специальным образом подготовленных бараньих эритроцитов. Для метода присущи те же недостатки, что и для методов I, II, IV, кроме того, он обладает недостаточно высокой чувствительностью.

Вышеуказанные недостатки устраняются в настоящем изобретении.

Краткое описание изобретения

Объектом защиты настоящего изобретения является ускоренный способ видовой идентификации шести видов (и двух подвидов) вирусов рода Orthopoxvirus. В качестве мишени для видовой идентификации выбран ген crmB, кодирующий вирусный аналог клеточного рецептора фактора некроза опухоли. Способ основан на двухстадийной ПЦР с получением одноцепочечного флуоресцентно меченого фрагмента ДНК с последующей гибридизацией на биочипе, содержащем набор дифференцирующих олигонуклеотидов, а также процедуры регистрации и интерпретации результатов.

Для осуществления способа используются биологические микрочипы, изготавливаемые из микроматриц, представляющих собой стеклянную подложку с нанесенными на нее гелевыми ячейками. Каждая гелевая ячейка содержит индивидуальный дифференцирующий олигонуклеотид.

Подготовка образца для гибридизации с иммобилизованными на чипе олигонуклеотидами заключается в получении одноцепочечного флуоресцентно меченного продукта методом двустадийной ПЦР. Первая стадия ПЦР осуществляется для амплификации исследуемого фрагмента гена crmB, вторая стадия носит название асимметричной ПЦР и направлена на преимущественную амплификацию лишь одной из цепей ДНК, используя ампликон из первого раунда ПЦР и праймер, меченный флуоресцентным красителем, например TexasRed®.

Гибридизация исследуемой ДНК с олигонуклеотидами микрочипа осуществляется путем инкубирования гибридизационной смеси в герметичной реакционной камере над чипом в течение нескольких часов при заданной температуре. Иммобилизованные на микрочипе олигонуклеотиды характеризуются видовой специфичностью к различным видам рода ортопоксвирусов.

Детекция флуоресцентного сигнала производится с сухого микрочипа после его отмывки с использованием детектирующего устройства, например, экспериментальной установки, состоящей из флуоресцентного микроскопа, ПЗС-камеры и компьютера либо портативной установки, в которой используется возбуждающий свет лазеров, а детекция флуоресцентного сигнала производится с использованием фотопленки. Интерпретация полученной гибридизационной картины проводится путем ее сравнения с набором стандартных, индивидуальных для каждого вида ортопоксвирусов, шаблонов.

Основными преимуществами способа идентификации ортопоксвирусов путем гибридизации амплифицированной флуоресцентно меченой ДНК на микрочипе являются:

– высокая надежность способа, основанная на одновременном анализе нескольких видоспецифичных участков гена crmB вирусов;

– быстрота проведения анализа;

– простота выполнения способа, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала;

– относительная дешевизна способа.

Другим объектом защиты, предлагаемым настоящим изобретением, является набор для осуществления способа, включающий:

а) микрочип, содержащий набор дифференцирующих олигонуклеотидов и использующийся для видовой диагностики ортопоксвирусов, и

б) при необходимости, – реагенты для выделения ДНК, праймеры для проведения ПЦР (для амплификации изучаемого фрагмента вирусного гена crmB), реагенты для проведения гибридизации, а также устройство для регистрации результатов анализа (например, портативный анализатор чипов, использующий в качестве возбуждающего источника свет лазеров и укомплектованный фотокамерой либо ПЗС-камерой).

Еще одним объектом изобретения является биологический микрочип, используемый в заявленном способе для осуществления видовой идентификации вирусов рода Orthopoxvirus и представляющий собой гелевую микроматрицу на стеклянной подложке, на которой иммобилизированы дифференцирующие олигонуклеотицы.

Еще одним объектом изобретения является набор дифференцирующих олигонуклеотидов, предназначенный для иммобилизации на биологическом микрочипе и характеризующийся видоспецифичностью (комплементарностью) к видам рода ортопоксвирусов.

Дополнительно изобретение поясняется чертежом, где представлены гибридизационные картины и их сравнение с шаблонами (контролем).

Подробное описание изобретения

Термины и определения, использованные в описании изобретения, означают указанное ниже.

Биологический микрочип – (биочип, ДНК-чип), пластинка-носитель площадью около 1 см², на которой в определенном порядке расположены ячейки, содержащие иммобилизованные одноцепочечные олигонуклеотиды с уникальной последовательностью оснований. Количество ячеек может составлять до 1 млн на 1 см².

Антиген – (от анти… и …ген) вещества, которые воспринимаются организмом как чужеродные, и вызывают специфический иммунный ответ.

Антитела – белки (иммуноглобулины) плазмы крови человека и теплокровных животных, обладающие способностью специфически связываться с антигенами. Взаимодействуя с микроорганизмами, они препятствуют их размножению или нейтрализуют выделяемые ими токсические вещества.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) – ферментативная реакция, использующая способность ДНК-полимеразы синтезировать новые цепи ДНК, используя в качестве матрицы уже имеющиеся молекулы ДНК по принципу комплементарности. Применение метода ПЦР позволяет в тысячи раз увеличивать количество изучаемого фрагмента в пробе, соответственно, увеличивая чувствительность методов, основанных на ПЦР-диагностике.

Амплификация – (от лат. amplificatio – расширение) – используется в молекулярной биологии для обозначения увеличения количества ДНК в процессе ПЦР.

Задача настоящего изобретения в создании экспресс-способа видовой идентификации ортопоксвирусов на биочипах. В способе предложено типирование по видоспецифичным участкам гена crmB, который удобен тем, что позволяет надежно идентифицировать шесть видов указанного рода. Предложен набор видоспецифичных олигонуклеотидных зондов (набор дифференцирующих олигонуклеотиды), иммобилизованных на чип. Использование стандартных методов выделения вирусной ДНК позволяет проводить анализ природных образцов, в том числе тканей животных и человека, на присутствие того или иного вируса рода Orthopoxvirus. При наличии специального оборудования способ может использоваться для диагностики в полевых условиях.

Принципиальная схема дифференциальной диагностики ортопоксвирусов на биочипе включает следующие пункты:

I. Принцип создания биочипа для видовой идентификации ортопоксвирусов.

1) Выбор мишени.

Продукт гена crmB – вирусный аналог клеточного рецептора фактора некроза опухоли человека и некоторых млекопитающих – одного из основных факторов вирулентности данной вирусной группы. Секретируясь инфицированной клеткой, он связывает клеточный фактор некроза опухоли, тем самым ингибируя цитокинопосредованный иммунный ответ. Видоспецифичность вышеуказанного цитокина млекопитающих, отражаясь на строении вирусного аналога рецептора, обуславливает узкую хозяиноспецифичность большинства ортопоксвирусов. Таким образом, ген crmB содержит консервативные видоспецифичные участки, подходящие для видовой идентификации.

2) Выделение ДНК.

Из природного образца (ткани животных и человека) выделяют ДНК, используя описанные в литературе методы выделения ДНК из животных клеток.

3) Выбор праймеров и дифференцирующих олигонуклеотидов.

Праймеры выбирали с учетом требований высокой специфичности к консервативным участкам гена crmB ортопоксвирусов, что позволяет избирательно амплифицировать изучаемый фрагмент непосредственно из природных образцов, а также требований, стандартно применяемых к праймерам – отсутствие высокостабильных вторичных структур и не превышающее 3-4°С расхождение температур плавления. Дифференцирующие олигонуклеотиды характеризуются видовой специфичностью к различным видам рода ортопоксвирусов.

II. Изготовление микроматрицы для иммобилизации олигонуклеотидов с целью получения биочипа.

Микроматрица, содержащая ячейки размером 100×100×20 мкм, приготовлена путем фотополимеризации 5%-го полиакриламидного геля, как описано ранее [11]. Гель активировали, после чего проводили нанесение растворов олигонуклеотидов и их ковалентное связывание с активными группами геля.

III. Подготовка образца к проведению анализа.

Фрагмент гена crmB амплифицируют с использованием высокоспецифичных праймеров. Полученный амплификат используют для наработки флуоресцентно меченной одноцепочечной ДНК для последующей гибридизации на микрочип. Для этого используется метод, так называемой, асимметричной ПЦР.

IV. Проведение гибридизации.

Флуоресцентно меченный ПЦР-продукт, получение которого описано в пункте III, затем гибридизуется с дифференцирующими олигонуклеотидами микрочипа в специально подобранном буфере в течение 4-6 часов.

V. Способ регистрации и интерпретации результатов гибридизации.

Дифференцирующие олигонуклеотиды разделены на пять групп в зависимости от видоспецифичного участка гена crmB. Интенсивность флуоресцентного сигнала образующихся совершенных дуплексов внутри каждой группы существенно выше интенсивности сигнала для несовершенных дуплексов, что позволяет проводить надежную видовую идентификацию ортопроксвирусов. Интерпретацию результатов проводят исходя из гибридизационной картины, которую получают, используя экспериментальную установку, включающую, например, флуоресцентный микроскоп, ПЗС-камеру и компьютер.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Олигонуклеотиды

Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystems) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. Для синтеза олигонуклеотидов для гибридизационного микрочипа использовали 3′-Amino-Modifier C7 CPG 500, так что синтезированный олигонуклеотид содержал на своем 3′-конце спейсер со свободной аминогруппой. Праймеры для проведения ПЦР модифицировали по 5′-концу при помощи 5′-Ammo-Modifier C6 (или C12) (Glen Research, VA).

Приготовление микроматрнцы для микрочипа.

Микроматрица, содержащая ячейки размером 100×100×20 мкм, приготовлена путем фотополимеризации 5%-го полиакриламидного геля, как описано ранее [11].

Гель активировали 2% трифторуксусной кислотой при комнатной температуре в течение 10 мин, отмывали водой и высушивали. Далее гель последовательно обрабатывали в Repel-Silane (2% раствор (вес/объем) диметилдихролсилана в 1,1,1-трихлорэтане, LKB-Produkter AB, Bromma, Sweden) – 30 с; дихлорметаном – 10 с; этанолом (95 об.%) – 10 с; промывали водой – 3 мин и высушивали.

1 мМ раствор олигонуклеотидов наносился иглой робота дважды в объеме 1 нл. Для стабилизации ковалентных связей между аминогруппами спейсеров, фланкирующих один из концов олигонуклеотидов, и альдегидными группами геля матрицу помещали в 0.1 М раствор пиридин-боранового комплекса (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee: WI) в хлороформе, наслаивали верхнюю водную фазу и выдерживали 12-16 часов при комнатной температуре. Далее биочип дважды промывали этанолом (95 об.%) и водой. Непрореагировавшие альдегидные группировки восстанавливали свежеприготовленным раствором 0.1 М NaBH₄ (Aldnch) в течение 20 минут при комнатной температуре. Биочип промывали водой, высушивали и хранили при комнатной температуре.

Подготовка материала для амплификации.

Выделение ДНК из природного образца (ткани животных и человека) осуществляют, используя описанные в литературе методы выделения ДНК из животных клеток.

Амплификация фрагмента гена crmB и получение одноцепочечного меченого продукта методом ПЦР.

Подготовку вирусной ДНК для гибридизации осуществляют с помощью двухстадийной ПЦР на амплификаторе GeneAmp PCR-system 2400 (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA). Для амплификации используют праймеры TNFR1f и TNFR3r, фланкирующие фрагмент длиной 267 п.н. для вируса оспы человека и варьирующийся по длине у других видов.

Первую стадию ПЦР проводят для получения выбранного фрагмента вирусной ДНК. Реакционный буфер содержит 16.6 мМ (MH₄SO₄, 67 мМ Tris-HCl, pH 8.6 при 25°С, 1.75 мМ MgCl₂, 120 мкМ dNTP, 0.1% Triton X-100, 1.5 Ед. активности Taq DNA полимеразы (Силекс, Москва, Россия) и 5 пМоль каждого из праймеров TNFR1f и TNFR3r в объеме 30 мкл.

Праймеры:

TNFR1f 5′-GCTTCCAGATTATGTGATAGCAAGACTA-3′

TNFR3r 5′-TexasRed®-NH-TCCGGATACTCCGTATCCTATTCC-3′

Температурный режим: денатурация при 95°С – 5 мин, затем 30 циклов амплификации (95°С 35 сек, 64°С 45 сек, 72°С – 45 сек), заключительная инкубация при 72°С – 5 мин. Два микролитра реакционной смеси после первой стадии ПЦР используют в качестве матрицы для проведения второй стадии.

Вторую стадию проводят для получения преимущественно одноцепочечного продукта, необходимого для гибридизации с дифференцирующими олигонуклеотидами. Для этого используют праймер TNFR1f и флуоресцентно меченный праймер TNFR3r, в соотношении 1/10 соответственно. Температурный режим был таким же, как и для первой стадии, количество циклов увеличивали до 35.

Гибридизация амплифицированного меченого продукта на биочипе 12 мкл образца, полученного в асимметричной ПЦР (˜1.2 мкг оцДНК), используют для гибридизации на биочипе в буфере следующего состава: 1 М NaCl, 50 мМ HEPES, pH 7.5, 5 мМ Na₂EDTA. Гибридизацию выполняют в коммерчески производимой гибридизационной камере, объемом 30 мкл (Sigma) в течение 4-6 часов при 37°С. Отмывку проводят трижды в буфере: 0.8 М NaCl, 50 мМ HEPES, pH 7.0, 6 мМ ЭДТА, 0.5% Twin 20 при 37°С, после чего чип высушивают.

Регистрация и интерпретация результатов гибридизации

Регистрацию гибридизационной картины проводят на экспериментальной установке, состоящей из флуоресцентного микроскопа, ПЗС-камеры и компьютера. Для цифровой обработки изображений применяют программу WinView (Princetone Instruments, USA). Измерение интенсивности флуоресцентных сигналов проводят при помощи оригинального программного обеспечения.

Интерпретацию результатов проводят следующим образом. Внутри каждого столбца гелевых ячеек, в котором содержатся олигонуклеотиды для одной из видоспецифичных позиций гена crmB визуально (или с использованием программного обеспечения) сравнивают интенсивности флуоресцентных сигналов. Гибридизуемая проба ДНК способна образовать совершенный дуплекс лишь с одним видоспецифичным олигонуклеотидом в каждом ряду, и несовершенные – со всеми остальными. Флуоресцентный сигнал совершенного дуплекса в каждом ряду в несколько раз превосходит сигналы несовершенных дуплексов. В результате в целом по чипу образуется гибридизационная картина, различная для шести видов ортопоксвирусов, что позволяет однозначно интерпретировать полученные данные.

Структура биочипа

Биологический микрочип содержит 15 иммобилизованных олигонуклеотидов, список которых представлен в таблице 1. В каждом из пяти вертикальных рядов биочипа содержатся олигонуклеотиды для какой-либо одной видоспецифичной позиции гена crmB. Таким образом, на чипе представлены олигонуклеотиды для пяти видоспецифичных позиций указанного гена, что позволяет проводить достоверную видовую идентификацию. Получаемая гибридизационная картина сравнивается с шаблонами (фиг.1), на основании соответствия одному из них проводится интерпретация полученных результатов.

Табл.1. Дифференцирующие олигонуклеотиды для видовой идентификации ортопоксвирусов.
№/№	Аминокислотная позиция	Штамм	Нуклеотидная последовательность, 5′-3′,3′-NH2	Длина, нукл.	Т пл. дуплекса (1 M NaCl), °С	G дуплекса, Ккал/моль
1	63, ins.	cow	СТАА(С/T)ACAAACACACA-NH2	16	61,8	-24,3
2	63	All the rest	СТАА(С/T)ACACAATGTAC-NH2	16	61,8	-23,0
3	63, subst.	rabbit+some v.v.	СТАА(С/T)ACACGATGTAC-NH2	16	64,4	-24,4
4	81	All the rest	TTACCCGCTTGTC-NH2	13	61,3	-25,4
5	81, subst.	monkey	TTACAGGCTTGTCT-NH2	14	60,5	-23,8
6	81, subst.	tatera	TTACCCACTTGTCT-NH2	14	60,5	-23,5

Пример 1. Дифференциальная диагностика ортопоксвирусов на биочипе.

Теоретические шаблоны и соответствующие им реальные гибридизациониые картины.

На чертеже представлена картина гибридизации образцов ДНК различных ортопоксвирусов и соответствующие каждому случаю шаблоны. Видно, что для каждого из приведенных видов ортопоксвирусов характерна уникальная гибридизационная картина. Внутри каждого столбца визуально отличима ячейка с наибольшей интенсивностью флуоресцентного сигнала, соответствующая совершенному дуплексу.

Преимущества способа

Способ видовой идентификации вирусов рода Orthopoxvirus на миниатюрном биологическом чипе выгодно отличается быстротой проведения анализа, простотой используемой методики подготовки образца вирусной ДНК для гибридизации, возможностью проведения анализа в полевых условиях, а также относительной дешевизной.

Список литературы

2. Мальцева Н.Н. 1980. Экспресс-диагностика заболеваний, вызванных ортопокс- и некоторыми герпес вирусами. Дисс. Докт., М.

9. Meyer, H., Pfeffer, М. & Rziha, H.-J. 1994. Sequence alterations Withinand downstream of the A-type inclusion protein genes allow differentiation of Orthopoxvirus species by polymerase chain reaction. J. Gen. Virol. Vol.75, 1975-1981.

11. Yershov, G., Barsky, V., Belgovskiy, A., Kirillov, Eu., Kreindlin, E., Ivanov, I., Parinov, S., Guschin, D., Drobishev, A., Dubiley, S. & Mirzabekov, A. 1996. DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchips. Proc. Nad. Acad. Sci. USA 93, 4913-4918.

Формула изобретения

1. Набор дифференцирующих олигонуклеотидов для видовой идентификации вирусов рода Orthopoxvirus, нуклеотидная последовательность которых приведена в табл.1.

2. Биологический микрочип для видовой идентификации вирусов рода Orthopoxvirus, представляющий собой пластинку-носитель, на которой расположена гелевая микроматрица, в ячейках которой иммобилизованы дифференцирующие олигонуклеотиды, охарактеризованные в п.1.

3. Набор для видовой идентификации вирусов рода Orthopoxvirus, включающий

а) биологический микрочип, охарактеризованный в п.2;

б) реагенты для подготовки образца и проведения идентификации;

в) устройство (устройства) для интерпретации результатов идентификации.

4. Набор по п.3, в котором реагенты для подготовки образца и проведения идентификации включают реагенты для выделения ДНК, реагенты для проведения ПЦР и реагенты для проведения гибридизации.

5. Набор по п.3, в котором в качестве устройства для интерпретации результатов идентификации используется портативный анализатор чипов, использующий в качестве возбуждающего источника свет лазеров и укомплектованный фотокамерой либо ПЗС-камерой.

6. Способ видовой идентификации вирусов рода Orthopoxvirus, включающий стадии:

а) приготовление биологического микрочипа, охарактеризованного в п.2, заключающееся в нанесении гелевой микроматрицы на стеклянную подложку и последующей иммобилизации дифференцирующих олигонуклеотидов, характеризованных в п.1;

б) амплификация фрагмента гена сппВ методом двухстадийной асимметричной ПЦР с использованием флуоресцентно меченного праймера для получения амплифицированной одноцепочечной вирусной ДНК;

в) гибридизация одноцепочечной ДНК, полученной из стадии б), с указанными дифференцирующими олигонуклеотидами на биологическом микрочипе, полученном согласно стадии а), путем инкубации указанного микрочипа в герметичной реакционной камере для образования дуплексов амплифицированных фрагментов вирусной ДНК с дифференцирующими олигонуклеотидами микрочипа;

г) регистрация полученного результата, осуществляемая путем детекции флуоресцентного сигнала меченого образца, и

д) интерпретация полученного результата, осуществляемая путем сравнения полученной гибридизационной картины с шаблонами.

7. Способ по п.6, согласно которому регистрацию флуоресцентного сигнала осуществляют визуально или с использованием программного обеспечения.

8. Способ по п.6, согласно которому интерпретацию полученной гибридизационной картины проводят путем сравнения ее с набором стандартных, индивидуальных для каждого вида шаблонов, подобранных таким образом, что флуоресцентный сигнал совершенного дуплекса позволяет однозначно провести видовую идентификацию вирусов рода Orthopoxvirus.

РИСУНКИ