Патент на изобретение №2270021

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСФЕР-ФАКТОРА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности ветеринарной иммунологии – способам получения биологически активных препаратов, обеспечивающих адаптивный перенос иммунологической информации. В способе используют лимфоузлы крупного рогатого скота, которые в дальнейшем подвергаются гомогенизации и гидролизу пепсином и ДНК-азой. Для гидролиза белка готовят 0,5%-ный раствор пепсина на 0,5%-ном растворе соляной кислоты. Суспензию, полученную после гомогенизации лимфоузлов, смешивают в стеклянной емкости с данным раствором в соотношении 1:10. Одновременно для деполимеризации ДНК в реагентную смесь вносят кристаллы MgSO₄ и лиофилизированный фермент ДНК-азу. Сосуд помещают в термостат на 24-28 ч при температуре 37-38°С. Периодически проверяют рН среды и при необходимости доводят его исходным раствором пепсина и соляной кислоты до оптимального значения 1,75-2,0. Контролем окончания гидролиза является отсутствие реакции на белок (биуретовая реакция). Полученный трансфер-фактор фильтруют и консервируют раствором карболовой кислоты до конечной концентрации раствора 0,5%. Изобретение позволяет упростить способ и получить большее количество лимфоциторной массы.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m””Studies on the chemical nature ofdialysable transfer factor. Comparison of human leukocyte dialysate and dialysates derived from human serum and from mammalian lymphoid and non-lymphoid organs”, Immunobiology. 1980 Jan; 156(4-5), P.353-363.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности ветеринарной иммунологии – способу получения биологически активного препарата – трансфер-фактора крупного рогатого скота, обеспечивающего адаптивный перенос иммунологической информации в другой организм.

Известен способ получения трансфер-фактора [1, 2, 3, 4], где в качестве объекта использовался человек. Эксперименты по его выделению на животных оказывались, как правило, неудачными [5, 6].

В качестве прототипа был выбран способ получения трансфер-фактора, предложенный Г. Фримель [3], который предусматривает следующие этапы:

1. Выделение лейкоцитов. Производят отбор крови от донора (на каждые 100 мл крови добавляют 500 ME гепарина). Кровь разливают в стерильные пробирки (25×155 мм), добавляют 2 мл раствора декстрана (60 г/л) в 0,15 М растворе натрия хлорида или инфуколла. Пробирки закрывают, несколько раз встряхивают и инкубируют при 37°С. Эритроциты осаждаются в течение 30-45 мин. Продолжительность седиментации составляет 1 час.

Желтоватый или красноватый слой надосадочной жидкости переносят при помощи пастеровской пипетки в конические центрифужные пробирки, которые центрифугируют в течение 10 мин при 1500g. Плазму осторожно сливают. Осевшие лейкоциты образуют слой над осадком эритроцитов. Осадок состоит на 70% из лимфоцитов. На слой лейкоцитов наслаивают 0,1 мл стерильного 0,15 М раствора натрия хлорида. Пастеровской пипеткой осторожно отсасывают лейкоциты в виде суспензии в изотоническом растворе натрия хлорида.

2. Диализ лейкоцитов. Для проведения диализа необходимо полное разрушение лейкоцитарной массы. Оно достигается 10-кратным замораживанием и оттаиванием суспензии. С этой целью пробирки с суспензией клеток замораживают смесью сухого льда с этанолом, а размораживают на водяной бане при 37°С. Процесс повторяют до тех пор, пока жидкость не станет вязкой. Для деполимеризации ДНК в раствор вносят несколько кристаллов лиофилизированного фермента ДНК-азы и небольшое количество ионов Mg (несколько кристаллов MgSO₄). Гидролиз осуществляют в течение 30 мин при 37°С.

Процесс диализа проводят для удаления высокомолекулярных компонентов. Обработанный ДНК-азой экстракт лейкоцитов переносят в диализный мешок, который предварительно ополаскивают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида и помещают в сосуд с дистиллированной водой. На 0,1 мл экстракта используют 5 мл дистиллированной воды.

Диализ проходит в течение 24 ч при 4°С. По окончании диализа раствор фильтруют через миллипоровский фильтр (диаметр пор 0,22 мкм) в стерильных условиях. Этап стерилизующей фильтрации является необходимым для очистки препарата от возможного бактериального загрязнения.

3. Получение трансфер-фактора. Диализат экстракта лейкоцитов растворяют в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с рН 7,4 в соотношении 1:20, при необходимости центрифугируют 20 мин при 10 тыс об/мин.

Выделение трансфер-фактора осуществляют на хроматографических колонках размером 20×530 или 50×1000 мм. Колонки с сефадексом G-25 промывают перед разделением тремя объемами разведенного в соотношении 1:20 раствора ФСБ с рН 7,4. Раствор диализата лейкоцитов вносят в колонку. Проводят восходящую хроматографию в этом же буфере со скоростью до 90 мл/час. Фракции собирают и консервируют лиофилизацией или другим способом.

Данный способ, наиболее близкий по технической сущности и выбранный за прототип, обладает следующими недостатками:

– высокая трудоемкость и сложность осуществления способа;

– использование крови (больших объемов) в качестве источника лейкоцитов;

– использование человека в качестве объекта для выделения трансфер-фактора (что делает невозможным использование препарата в ветеринарии из-за его специфичности).

Целью изобретения является устранение указанных недостатков. Поставленная цель достигается тем, что в качестве объекта для выделения трансфер-фактора используется крупный рогатый скот. Исходным материалом для выделения лимфоцитов служат регионарные лимфатические узлы, содержащие большое количество Т и В-лимфоцитов, наиболее активных в осуществлении реакции иммунологического переноса [7, 8]. Из технологического процесса получения трансфер-фактора исключены: 10-кратное замораживание и оттаивание, диализ и последующая хроматография исходной суспензии лимфоцитов, так как все выделенные при этом фракции являются активными [9].

Предлагаемый способ получения трансфер-фактора крупного рогатого скота осуществляется следующим образом:

1. Получение экстракта лимфоцитов. Регионарные лимфоузлы (предлопаточные, надколенной складки и другие) отбирают при убое здорового крупного рогатого скота. Их освобождают от соединительной ткани и жира и измельчают на мелкие кусочки, помещают в гомогенизатор, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:1 и подвергают гомогенизации до однородной консистенции при 20 тыс об/мин в течение 2-3 мин. Такой режим обработки лимфоидной ткани обеспечивает полное разрушение клеточных структур.

2. Гидролиз экстракта лимфоцитов и получение трансфер-фактора. Для осуществления гидролиза белка готовят 0,5%-ный раствор пепсина на 0,5%-ном растворе соляной кислоты. Суспензию, полученную после гомогенизации лимфоузлов, смешивают в стеклянной емкости с данным раствором в соотношении 1:10. Одновременно для деполимеризации ДНК в реагентную смесь вносят кристаллы MgSO₄ в количестве 0,015-0,017 мг и лиофилизированный фермент ДНК-азу в количестве 0,004-0,006 мг. Сосуд помещают в термостат на 24-28 ч при температуре 37-38°С. Периодически проверяют рН среды и при необходимости доводят его исходным раствором пепсина и соляной кислоты до оптимального значения 1,75-2,0. Контролем окончания гидролиза является отсутствие реакции на белок (биуретовая реакция)

Полученный трансфер-фактор фильтруют и консервируют раствором карболовой кислоты до конечной концентрации раствора 0,5%.

Сравнительный анализ заявленного решения со способом, выбранным за прототип, показал, что новое решение обладает следующими отличительными признаками:

– выбор в качестве объекта для получения трансфер-фактора крупного рогатого скота;

– использование в качестве исходного материала для получения лимфоцитарной массы регионарных лимфоузлов;

– упрощение технологии получения препарата;

– специфичность конечного продукта для крупного рогатого скота.

Наличие отличительных от прототипа признаков обеспечивает соответствие заявляемого технического решения критерию “новизна”.

Анализ доступных авторам источников информации показал, что сведений о получении трансфер-фактора из лимфоузлов крупного рогатого скота нет.

Таким образом, все указанные отличительные признаки являются необходимыми и существенными, тесно связаны между собой, и поэтому трудно выделить вклад каждого отдельного признака в достижении поставленной цели.

Проведенные испытания заявляемого способа получения трансфер-фактора подтверждают его преимущества перед способом-прототипом.

Пример: схема получения трансфер-фактора.

1. Получение экстракта лимфоцитов. Регионарные лимфоузлы (предлопаточные, надколенной складки и другие), отобранные при убое здорового крупного рогатого скота, освобождают от соединительной ткани и жира и измельчают на мелкие кусочки, 100 г ткани помещают в гомогенизатор, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:1 и подвергают гомогенизации до однородной консистенции при 20 тыс об/мин в течение 2-3 мин.

2. Гидролиз экстракта лимфоцитов и получение трансфер-фактора.

Затем осуществляют гидролиз белков, находящихся в гомогенизате.

Для этого готовят 0,5%-ный раствор пепсина на 0,5%-ном растворе соляной кислоты. Суспензию, полученную после гомогенизации лимфоузлов, смешивают в стеклянной емкости с данным раствором в соотношении 1:10. Одновременно для деполимеризации ДНК в реагентную смесь вносят кристаллы MgSO₄ в количестве 0,015-0,017 мг и лиофилизированный фермент ДНК-азу в количестве 0,004-0,006 мг. Затем сосуд помещают в термостат на 24-28 ч при температуре 37-38°С и периодически проверяют рН среды. При необходимости доводят его исходным раствором пепсина и соляной кислоты до оптимального значения 1,75-2,0. Контролем окончания гидролиза является отсутствие реакции на белок (биуретовая реакция).

Полученный целевой продукт в количестве 1200 мл фильтруют и консервируют раствором карболовой кислоты до конечной концентрации раствора 0,5%.

Трансфер-фактор крупного рогатого скота представляет собой слегка опалесцирующую жидкость светло-желтого или светло-коричневого цвета с незначительным осадком, легко разбивающимся при встряхивании, не содержит белок, содержит полипептиды и олигонуклеотиды, устойчив к повторному замораживанию и размораживанию, лиофилизации, устойчив к действию РНК-азы, ДНК-азы, трипсина.

Полученные преимущества предлагаемого способа позволяют рекомендовать его для широкого применения в ветеринарной практике с целью получения трансфер-фактора.

Литература

1. Петров Р.В. Иммунология. – М.: Медицина, 1983 – 368 с.

2. Смирнов B.C. Иммунодефицитные состояния. – СПб.: “Фолиант”, 2000 – 568 с.

3. Фримель Г. Иммунологические методы. – М.: Медицина, 1987 – 472 с.

4. Schroder I., Rovensky J. In vitro determination of effects of dialyzable leukocyte extracts containing transfer factor activity. – Allergol. et Immunopathol., 1982, 10, 171.

5. Uotila A. Studies on the chemical nature of dialyzable transfer factor. Comparison of human leukocyte dialyzate and dialysates derived from human serum and from mammalian lymphoid and non-lymphoid organs. – Immunobiol., 1979, 156, 353.

6. Wilson G.В., Fudenberg H.H., Horsmanheimo М. Effects of dialyzable leukocyte extracts with transfer factor activity on leukocyte migration in vitro. 1. Antigen-dependent inhibition and antigen-dependent inhibition and enhancement of migration. 2. Separation and partial characterization of the components in DLE producing antigen-dependent and antigen-independent effects. – J. Lab. Clin. Medicine, 1979, 93, 800.

7. Bhardwaj N., Brummer E., Foster L. G. et al. Transfer of DTN to SK-SD and tetanus toxoid in BALB/c mice by TFd prepared from purified subpopulations of murine lymphocytes. – In: Immune regulators in transfer factor/Eds. A. Khan. et al. – New York: Academic Press 1979, 285.

8. Brummer E., Foster L. G., Bhardwaj N. et al. A murine model for studying the transfer of DTH with dialyzable human transfer factor. – ibid., p.27.

Формула изобретения

Способ получения трансфер-фактора, включающий приготовление экстракта лимфоцитов, гидролиз ДНК-зой, фильтрацию с последующей консервацией целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве источника лимфоцитов используются региональные лимфоузлы крупного рогатого скота, которые измельчают в дистиллированной воде в соотношении 1:1, затем гомогенизируют до однородной массы при 20000 об/мин в течение 2-3 мин, гомогенат смешивают с 0,5%-ным раствором пепсина в 0,5%-ной соляной кислоте в соотношении 1:10, добавляют 0,015-0,017 мг MgSO₄ 0,004-0,006 мг ДНК-азы, термостатируют реакционную смесь при 37-38°С 24-28 ч, рН 1,75-2,0, целевой продукт отделяют фильтрованием и консервируют раствором карболовой кислоты.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 17.01.2006

Извещение опубликовано: 20.02.2007 БИ: 05/2007