Патент на изобретение №2270020

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНТРОЛЬНОЙ ПЛАЗМЫ С НОРМАЛЬНЫМ УРОВНЕМ ПРОТРОМБИНОВОГО КОМПЛЕКСА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине и касается получения лиофилизированного диагностического реагента – контрольной плазмы с нормальным уровнем протромбированного комплекса. Способ включает забор крови от доноров, отделение плазмы центрифугированием, объединение плазмы доноров, центрифугирование пула, розлив и лиофилизацию готового продукта, отличающийся тем, что после повторного центрифугирования к пулу плазмы добавляют буферное вещество HEPES до конечной концентрации 0,004±0,0005 М, затем замораживают и закаливают при температуре не выше – 38°С в течение 4-6 часов, лиофилизацию проводят начиная с температуры продукта не выше -(54±14°С), с выходом на положительную температуру через 10±1 час и завершением процесса лиофилизации при температуре +(12±3)°С, используя график сушки продолжительностью 17±1 час. Способ обеспечивает получение диагностического реагента, содержащего нормальный уровень протромбинового комплекса, стабильного в течение 1 года для расчета протромбинового индекса по формуле %-ПИ и/или построения калибровочного графика для расчета активности факторов протромбинового комплекса. 2 табл., 1 ил.

Изобретение относится к медицине и касается получения лиофилизированного диагностического реагента – контрольной плазмы с нормальным и стабильным в течение не менее 1 года уровнем факторов протромбинового комплекса, используемого для расчета протромбинового индекса (%-ПИ) по формуле и/или построения калибровочного графика для расчета активности факторов протромбинового комплекса.

В настоящее время существуют многочисленные модификации методов определения указанных прокоагулянтов, при воспроизведении которых используют разные контрольные реагенты для построения калибровочных графиков и аналитических расчетов по формуле. Это затрудняет получение сравнимых результатов. Зарубежные фирмы (Boehringer Mannheim, Dade, Sigma, George king bio-medical, Hospitex diagnostics, Human, Grifols, Biomerieux) выпускают лиофилизированные реагенты: Международные и Национальные. Однако технология их изготовления запатентована. Кроме того, импортные диагностикумы и тест-системы дорогостоящие.

В качестве прототипа использован разработанный нами ранее “Способ получения донорской стандарт-плазмы” (патент N 1592717, авторы: Г.К.Платонова, Л.Н.Тарасова). Существенным недостатком прототипа является то, что используемый график сушки достаточно продолжителен и составляет не менее 24 часов; максимальная температура продукта не выше +5°С. Кроме того, дорогостоящий реагент HEPES вводят непосредственно в консервирующий раствор перед взятием крови; происходит его потеря при осаждении форменных элементов.

Целью настоящего изобретения является получение диагностического реагента – контрольной плазмы из свежего донорского пула, объединенного не менее чем от 15 доноров, содержащего нормальный уровень протромбинового комплекса, стабильного в течение 1 года, для расчета протромбинового индекса по формуле (%-ПИ) и/или построения калибровочного графика для расчета активности факторов протромбинового комплекса.

Поставленная цель достигается тем, что буферное вещество HEPES вносят в плазму из расчета 0,004±0,0005 М после отделения форменных элементов, а не в донорскую кровь, и высушивают методом лиофилизации по следующему графику сушки: начальная температура продукта не выше минус 54±14°С, выход на положительную температуру через 10±1 час и завершение при температуре 12±3°С; продолжительность процесса сублимации равняется 17±1 час.

После лиофилизации определяют потерю в массе при высушивании, которая не должна превышать 2%; рН 7,35±0,15; протромбиновый индекс должен находиться в пределах 99±5%, концентрация фибриногена 2,75±0,75.

ПРИМЕР ОПИСАНИЯ СПОСОБА

Контрольную плазму с нормальным уровнем факторов протромбинового комплекса получают следующим образом: кровь не менее 15 доноров берут во флаконы с консервантом (цитрат натрия, азид натрия и контрикал) в соотношении 9:1. Центрифугируют при 1800-2000 об/мин и температуре +(4-6)°С в течение 30 минут. Полученные образцы плазмы каждого донора отделяют от форменных элементов, смешивают, получая пул, и повторно центрифугируют при том же режиме. Супернатант отделяют и добавляют в него буферное вещество HEPES до конечной концентрации 0,004±0,0005 М. Полученную нативную контрольную плазму разливают по 1 мл в силикони-рованные пенициллиновые флаконы емкостью 10 мл. Замораживают и закаливают на плите сублиматора при температуре не выше -38°С в течение 4-6 часов. Сублимационную сушку проводят согласно графику сушки контрольной плазмы (табл.2, чертеж).

После лиофилизации определяют потерю в массе при высушивании диагностического реагента, протромбиновый индекс (%-ПИ), а также концентрацию фибриногена. В качестве контроля при расчете %-ПИ используют пул свежей плазмы не менее 20 доноров. Если этот показатель находится в пределах 99±5%, а концентрация фибриногена (Ф) не менее 2,0 г/л, реагент используют как контрольную плазму для расчета протромбинового индекса и/или активности факторов протромбинового комплекса при проведении исследований с пробами плазмы больных и/или здоровых лиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

(проведены на базе лаборатории биохимии крови ГУ Кировский НИИ гематологии и переливания крови и Республиканской станции переливания крови при институте).

Разработанный способ использован при получении 5 серий контрольной плазмы. При изготовлении серий 040901, 010302, 020602, 030902 и 041202 использовали кровь 17, 17, 16, 18 и 20 доноров соответственно. Потеря в массе при высушивании реагента всех полученных серий не превышала 2%. Определение рН, протромбинового индекса и фибриногена образцов контрольной плазмы проводили после лиофилизации, через 6 и 12 мес. Результаты исследований приведены в таблице 1. Они свидетельствуют о том, что полученный реагент можно применять как контрольную плазму с нормальным и стабильным в течение не менее 1 года уровнем факторов протромбинового комплекса и использовать для расчета протромбинового индекса (%-ПИ) по формуле и/или построения калибровочного графика для расчета активности протромбинового комплекса.

Разработанный способ найдет применение при создании производственной технологии изготовления отечественной контрольной донорской плазмы, использование которой в клинико-диагностических и специализированных гемостазиологических лабораториях удобно, позволяет получить сравнимые результаты исследований; кроме того, реагент значительно дешевле зарубежных аналогов.

Формула изобретения

Способ получения лиофилизированной контрольной плазмы с нормальным уровнем протромбинового комплекса, включающий взятие крови от доноров во флаконы с консервантом, отделение плазмы центрифугированием при 1800-2000 об/мин в течение 30 мин, отделение ее от форменных элементов, объединение плазмы доноров в пул, центрифугирование пула при тех же условиях, розлив и лиофилизацию, отличающийся тем, что после повторного центрифугирования к пулу плазмы добавляют буферное вещество HEPES до конечной концентрации (0,004±0,0005)М, затем замораживают и закаливают при температуре не выше -38°С в течение 4-6 ч, лиофилизацию проводят, начиная с температуры продукта не выше – (54±14)°С с выходом на положительную температуру через (10±1) ч и завершением процесса лиофилизации при температуре +(12±3)°С, используя график сушки продолжительностью (17±1) ч.

РИСУНКИ