Патент на изобретение №2268943
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИН-5′-ТРИФОСФАТА
(57) Реферат:
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в медицине, экологии, фармацевтике и пищевой промышленности. Реагент для определения аденозин-5′-трифосфата представляет собой водный раствор люциферазы светляков, содержащий люциферин, сульфат магния, трис(оксиметиламинометан), уксусную кислоту, этилендиаминотетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин и стабилизатор, выбранный из группы, включающей полибрен, поливинилпирролидон, N-фталилхитозан и сахарозу. Применение изобретения позволяет повысить точность и воспроизводимость определения АТФ. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к области биохимии, а именно к составу реагента для количественного определения аденозин-5′-трифосфата (АТФ) на основе фермента – люциферазы светляков. Интенсивность биолюминесценции, которая возникает в реакции люциферина, кислорода и АТФ, катализируемой люциферазой светляков, прямо пропорциональна концентрации АТФ. Данная реакция широко используется в аналитических целях для определения АТФ, а именно в медицине, промышленности и экологии. С использованием реагента для определения аденозин-5′-трифосфата разработаны методики быстрого контроля микробиологической чистоты продуктов питания, пищевого сырья, лекарств, косметических товаров, технологических материалов, воды и напитков. Расчеты показывают, что потребности в определении АТФ для этих целей могут достигать миллионов определений в год, если стоимость реагента будет достаточно низкой, а активность и стабильность реагента будут достаточно высокими. Наиболее близким к заявляемому является Патент РФ №2164241, 1999, (Дементьева Е.И., Кутузова Г.Д., Лундовских И.А., Угарова Н.Н. Реагент для определения аденозин-5′-трифосфата”), принятый за прототип, в котором предложен реагент для определения аденозин-5′-трифосфата, включающий люциферазу, иммобилизованную на полисахаридном носителе, выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, очищенную осаждением 35-75%-ным сульфатом аммония, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом в качестве стабилизатора, дополнительный стабилизатор – смесь бычьего сывороточного альбумина и трегалозы и воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Недостатком прототипа является невысокая каталитическая активность иммобилизованной люциферазы, поскольку при иммобилизации теряется около 80% активности фермента, что делает необходимым использовать для анализа АТФ относительно высокие количества реагента и тем самым увеличивает расход реагента для определения АТФ. Недостатком прототипа также является неоднородность суспензии иммобилизованной люциферазы, что приводит к довольно высокой погрешности результатов при определении ультрамалых концентраций АТФ. Недостатком прототипа является, кроме того, и то, что иммобилизация усложняет процедуру получения реагента, при этом используют дорогостоящий импортный носитель, а в качестве одного из дополнительных стабилизаторов используют высокие концентрации трегалозы. Задачей настоящего изобретения является повышение активности реагента для определения АТФ, повышение правильности и воспроизводимости определения АТФ, снижение расхода фермента для получения реагента, упрощение процедуры приготовления реагента, а также использование более доступных и эффективных дополнительных стабилизаторов. Для решения поставленной задачи предлагаются реагенты для определения АТФ, включающие 0,001-0,01 мас.% растворимой люциферазы, выделенной из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис-(оксиметил)-аминометана, 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминтетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, воду, а также дополнительный стабилизатор в количестве, эффективном для стабилизации композиции, в качестве которого используют или полибрен (1,5-диметил-1,5-диазоундекаметилен-полиметобромид) в количестве 0,0002-0,02 мас.%, или поливинилпирролидон в количестве 0,5-1,0 мас.%, или N-фталил-хитозан в количестве 0,02-0,1 мас.%, или сахарозу в количестве 10-20 мас.%. Преимуществом предлагаемых реагентов является снижение расхода фермента при приготовлении, повышение активности, упрощение процедуры получения реагентов, повышение правильности и воспроизводимости определения АТФ и использование в качестве дополнительных стабилизаторов более доступных по сравнению с трегалозой веществ. Получение плазмид, штаммов E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы, наращивание биомассы клеток, выделение и очистку люциферазы проводят по методу, описанному в прототипе. Реагенты получают добавлением к концентрированному раствору люциферазы, содержащему 20-100 Е/мл активного фермента, определенного объема трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего люциферин, сульфат магния, этилендиаминтетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин и воду, и в качестве дополнительного стабилизатора – или полибрен (1,5-диметил-1,5-диазоундекаметилен-полиметобромид) в количестве 0,0002-0,02 мас.%, или поливинилпирролидон в количестве 0,5-1,0 мас.%, или N-фталил-хитозан в количестве 0,02-0,1 мас.%, или сахарозу в количестве 10-20 мас.%. После тщательного перемешивания раствор в стерильных условиях фильтруют через бактериальный фильтр, разливают во флаконы, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон добавляют определенный объем деионизованной стерильной воды, получая реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5-5 Е/мл. Изобретение поясняется следующими примерами, которые имеют иллюстративный, но не ограничительный характер. Пример 1. Приготовление реагента для определения АТФ на основе растворимой люциферазы, выделенной из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы святляков а. К 1 мл раствора люциферазы, полученной, как описано в прототипе, с активностью 20 Е/мл в 0,05 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем 10 мМ сульфат магния, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол, добавляют 39 мл 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 0,002 мг/мл полибрен, тщательно перемешивают, фильтруют через стерильный фильтр в стерильную колбу, разливают в стерильные флаконы по 1,0 мл, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон с лиофилизованным реагентом добавляют 1,0 мл деионизованной стерильной воды. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
б. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 1 мМ люциферин, 30 мМ сульфат магния, 6 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 0,2 мг/мл полибрен. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
в. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют 1 мл раствора люциферазы с активностью 100 Е/мл и 19 мл 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 0,2 мг/мл N-фталил-хитозан. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 5 Е/мл, при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
г. Все операции проводят, как описано в примере 1в, но для приготовления реагента используют 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 1 мМ люциферин, 30 мМ сульфат магния, 6 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 1 мг/мл N-фталил-хитозан. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
д. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 5 мг/мл поливинилпирролидон. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
е. Все операции проводят, как описано в примере 1д, но используют 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 10 мг/мл поливинилпирролидон. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
ж. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют люциферазу с активностью 50 Е/мл и 39 мл 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 100 мг/мл сахарозу и получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 1,25 Е/мл, при следующем соотношении компонентов:
з. Все операции проводят, как описано в примере 1ж, но используют буферный раствор, содержащий 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 200 мг/мл сахарозы. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 1,25 Е/мл, при следующем соотношении компонентов:
Пример 2. Методика измерения концентрации АТФ 0,05 мл реагента, полученного, как описано в примере 1, вводят в цилиндрическую микрокювету объемом 0,2 мл и диаметром 7 мм. Кювету помещают в кюветное отделение люминометра и регистрируют фоновый сигнал, который, как правило, равен 0. Добавляют 0,05 мл раствора АТФ с известной концентрацией. Раствор быстро перемешивают и регистрируют интенсивность биолюминесценции. Операцию повторяют не менее двух раз. Измерения повторяют для растворов АТФ различной концентрации. Результаты измерений с использованием реагентов, полученных по примеру 1, показаны в таблице 1. Прямая пропорциональная зависимость биолюминесценции от концентрации АТФ наблюдается в диапазоне концентраций АТФ от 10-13 до 10-8 М. По полученным данным строят градуировочный график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ. Концентрацию АТФ в неизвестном образце определяют по интенсивности биолюминесценции, регистрируемой для неизвестного образца, как описано выше, используя градуировочный график. При работе с концентрациями АТФ от 10-11 Ми выше предпочтительнее использовать реагент, описанный в примерах 1д-1з, с концентрациями АТФ от 10-12 М и выше – реагент, описанный в примерах 1в и 1 г, а с концентрациями АТФ от 10-13 М и выше – реагент, описанный в примерах 1а и 1б. Пример 3. Испытание стабильности реагента Раствор реагента, приготовленного, как описано в примере 1, инкубируют при 20°С и через определенные интервалы времени отбирают пробу и определяют интенсивность биолюминесценции, как описано в примере 2, для раствора АТФ с фиксированной концентрацией. Из данных зависимости интенсивности биолюминесценции от длительности инкубации определяют полупериод инактивации реагента в растворе. Результаты приведены в таблице 2.
Формула изобретения
1. Реагент для определения аденозин-5′-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 0,0002-0,02% полибрена и воду. 2. Реагент для определения аденозин-5′-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 0,5-1,00 мас.% поливинилпирролидона и воду. 3. Реагент для определения аденозин-5′-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 0,02-0,1 мас.% N-фталилхитозана и воду. 4. Реагент для определения аденозин-5′-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 10-20 мас.% сахарозы и воду. 5. Реагент по пп.1-4, отличающийся тем, что в качестве люциферазы используют люциферазу, выделенную из клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков.
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 20.02.2006
Извещение опубликовано: 27.01.2007 БИ: 03/2007
NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение
Извещение опубликовано: 27.01.2007 БИ: 03/2007
PC4A – Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение
(73) Патентообладатель(и):
(73) Патентообладатель:
Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 19.02.2007 № РД0018854
Извещение опубликовано: 27.03.2007 БИ: 09/2007
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
