Патент на изобретение №2268934
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ СОЛОНОВАТОВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ
(57) Реферат:
Изобретение относится к экологической биотехнологии и микробиологии. Для очистки солоноватоводных экосистем от загрязнения нефтью и нефтепродуктами прпедлагается новый бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, выделенный из морских вод Северного Каспия в районе разведочного бурения нефтяных скважин. Штамм выращивают на стандартных средах и средах с добавлением морской соли. Деструктивная активность препарата на основе штамма против углеводородов нефти и нефтепродуктов составляет 54,5-96% в диапазоне солености морской воды 0,05-20%. 4 табл.
Изобретение предназначено для использования в экологической биотехнологии, микробиологии при разработке способов биологической очистки водных экосистем от загрязнения нефтью и нефтепродуктами, в частности бактериальным штаммом Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, обладающим способностью активизировать процесс деструкции нефтяных углеводородов. Известны способы очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, где используются монокультуры бактерий родов Pseudomonas, Rhodococcus [см. а.с. СССР №1428809, кл. С 02 F 3/34, 1985; патент РФ №2039714, 1993]. Однако применение этих бактерий для увеличения эффективности очистки воды и почвы от нефтяного загрязнения требует внесения дополнительных минеральных источников питания (азота, фосфора и др.). Наиболее близким по сути к заявленному изобретению (прототипом) является способ получения бактериального препарата для очистки водной среды от нефтяного загрязнения, включающий наращивание биомассы бактерий Pseudomonas putida – 36 ЦМПМ И-2443 и ее последующее высушивание [а.с. СССР №1076446, кл. С 02 F 3/34, 1982]. Недостатками способа является то, что максимальная эффективность данного препарата достигается лишь при предварительном “оживлении” биомассы подогревом воды (5 м3) до t=18-28°C, аэрировании 12-16 часов и перемешивании, что является достаточно трудоемкими процессами. Техническим результатом данного изобретения является способность штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 к деструкции нефтяных углеводородов солоноватоводных экосистем. Анализ литературных данных и известных технических решений показывает, что не имеется сведений об использовании бактерий рода Phyllobacterium в качестве нефтеокисляющих бактерий. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условиям патентоспособности “новизна”, “изобретательский уровень”. Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 выделен из морских вод Северного Каспия, отобранных в районе разведочного бурения нефтяных скважин. Филогенетическое положение штамма проведено на основании секвенирования гена 16S рРНК в Центре “Биоинженерия” РАН и ИНМИ РАН. Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками. 1. Культурально-морфологические признаки Грамвариабельные прямые подвижные палочки, спор не образуют. Колонии на МПА круглые, выпуклые, блестящие, слизистые, 1-2 мм в диаметре. Край ровный. Пигментация колоний от светло-розовой до красной. На МПБ культуры образуют однородную муть и осадок, на жидкой среде Миллса с нефтью – пленка розового цвета. 2. Физиолого-биохимические признаки Оксидазоположительные, каталазоположительные, галотолерантные (рост в интервале солености 0,05-20% NaCl), не гидролизуют крахмал, казеин, пектин и целлюлозу, не разжижают желатин, не образуют сероводород и индол, восстанавливают нитраты в нитриты, образуют кислоту из глюкозы, не окисляют лактозу. Не имеют аргининдегидролазы, лизин – и орнитиндекарбоксилаз, уреазы, фенилаланиндезаминазы, 3. Условия культивирования Культивирование штамма проводят при температуре от 22 до 30°С, оптимум 28°С, при значениях рН среды от 7,0 до 9,0, оптимум 7,1. Время культивирования для получения необходимой биомассы составляет 2 суток. 4. Хранение штамма. Для сохранения штамма используют метод периодических пересевов (3-4 раза в год) на МПА или агаре Чапека. Инкубирование после пересева ведут при температуре 28°С в течение 3-4 дней, затем культуру хранят в холодильнике при температуре 4°С. Штамм хранится в лаборатории микробиологического мониторинга кафедры «Прикладная биология и микробиология» Астраханского государственного технического университета. Применение штамма. Пример 1. В аквариумы (объемом 6000 мл), содержащие 5000 мл морской воды соленостью 10 промилле, вносили сырую стерильную нефть (1% по объему) и суспензию Ph.myrsinacearum DKS-1 из расчета 2,0×166 кл/мл, предварительно выращенных на МПА в течение 2-х суток при 28°С, дважды отмытых от агара дистиллированной водой, отделенных центрифугированием (8 тыс. об/мин) и ресуспендированных в стерильной морской воде. Контролем служили аквариумы с морской водой с добавлением стерильной нефти (1% по объему) без внесения микроорганизмов. Начальное содержание нефтяных углеводородов во всех аквариумах опыта составило 190 мг/л. Аквариумы инкубировали при комнатной температуре в течение 30 суток. Через 3, 10, 20, 30 суток в аквариумах определяли содержание суммарных нефтяных углеводородов флюориметрическим методом. В ходе экспозиции Ph.myrsinacearum DKS-1 показал способность к активизации процесса деструкции нефти. Убыль суммарных нефтяных углеводородов в течение 30 суток составила 96,0%, что на 30% превышает аналогичный показатель в сравнении с контролем, где разрушение нефтяных углеводородов происходит в результате физико-химических процессов и деятельности аборигенной микрофлоры морской воды. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.
Пример 2. В колбы Эрленмейера (объемом 250 мл), содержащие 100 мл стерильной морской воды соленостью 10 промилле, вносили сырую стерильную нефть (1% по объему) и 1,0 мл суспензии Ph.myrsinacearum DKS-1 (2,0×166 кл/мл), предварительно выращенных на МПА в течение 2-х суток при 28°С, дважды отмытых от агара дистиллированной водой, отделенных центрифугированием (8 тыс. об/мин) и ресуспендированных в стерильной морской воде. Контролем служили колбы со стерильной морской водой без добавления суспензии Ph.myrsinacearum DKS-1 с добавлением стерильной сырой нефти (1% по объему). Колбы инкубировали на перемешивающем устройстве (45 кол/мин) при комнатной температуре в течение 10 суток. Через 1, 3, 7, 10 суток в колбах определяли титр клеток и содержание суммарных нефтяных углеводородов флюорометрическим методом. В ходе экспозиции Ph.myrsinacearum DKS-1 показал способность к деструкции нефти. Убыль нефтяных углеводородов в течение 10 суток составила 66,1%. Результаты представлены в таблице 2.
Пример 3. В колбы Эрленмейера (объемом 250 мл), содержащие 100 мл среды Чапека (стандартная), вносили сырую стерильную нефть (1% по объему) и 1,0 мл суспензии Ph. myrsinacearum DKS-1 (2,0×166 кл/мл), предварительно выращенных на МПА в течение 2-х суток при 28°С, дважды отмытых от агара дистиллированной водой, отделенных центрифугированием (8 тыс. об/мин) и ресуспендированных в стерильной морской воде. Контролем служили колбы со средой Чапека без добавления суспензии Ph.myrsinacearum DKS-1 и с добавлением сырой стерильной нефти (1% по объему). Колбы инкубировали на перемешивающем устройстве (45 кол/мин) при комнатной температуре в течение 10 суток. Через 1, 2, 3, 7, 10 суток в колбах определяли титр клеток и содержание суммарных нефтяных углеводородов. В ходе экспозиции Ph.myrsinacearum DKS-1 показал способность к активизации процесса деструкции нефти. Убыль нефтяных углеводородов в течение 10 суток составила 72,2%. Результаты представлены в таблице 3.
Пример 4. В колбы Эрленмейера (объемом 250 мл), содержащие 100 мл среды Миллса (NaCl – 24,0 г/л; MgSO4·7H2O – 1,0 г/л; KCl – 0,7 г/л; K2HPO4 – 2,0 г/л; Na2HPO4 – 3,0 г/л; NH4NO3 – 1,0 г/л), вносили сырую стерильную нефть (1% по объему) и 1,0 мл суспензии Ph.myrsinacearum DKS-1 (2,0×166 кл/мл), предварительно выращенных на МПА в течение 2-х суток при 28°С, дважды отмытых от агара дистиллированной водой, отделенных центрифугированием (8 тыс. об/мин) и ресуспендированных в стерильной морской воде. Контролем служили колбы со средой Миллса без добавления суспензии Ph.myrsinacearum DKS-1 и с добавлением сырой стерильной нефти (1% по объему). Колбы инкубировали на перемешивающем устройстве (45 кол/мин) при комнатной температуре в течение 10 суток. Через 1, 2, 3, 7, 10 суток в колбах определяли титр клеток и содержание суммарных нефтяных углеводородов. В ходе экспозиции Ph.myrsinacearum DKS-1 показал способность к активизации процесса деструкции нефти. Убыль нефтяных углеводородов в течение 10 суток составила 54,5%. Результаты представлены в таблице 4.
Таким образом, представленные экспериментальные данные показывают способность штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 использовать нефтяные углеводороды в качестве источника питания и энергии и рассматривать его деструктором нефтяных углеводородов в солоноватоводных экосистемах. Изобретение обеспечивает достижение технического результата, может быть использовано на практике, обеспечивает возможность воспроизводимости, что удовлетворяет условию патентоспособности “промышленная применимость”.
Формула изобретения
Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, используемый для деструкции нефтяных углеводородов солоноватоводных экосистем.
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 29.10.2006
Извещение опубликовано: 20.02.2008 БИ: 05/2008
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
-галактозидазы, не утилизируют цитрат и малонат натрия, цитрат натрия с глюкозой. Способен к росту на средах Чапека, Миллса, магниево-калиево-дрожжевой (МКД), Маккланга как с добавлением дизельного топлива и нефти, так и без добавления.