Патент на изобретение №2155068

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО АНТИГЕННЕЗАВИСИМУЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ В-ЛИМФОЦИТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к получению биологически активных веществ, стимулирующих антигеннезависимую дифференцировку В-лимфоцитов, из ткани сумки Фабрициуса птиц. Способ заключается в гомогенизации предварительно замороженного сырья с последующей экстракцией 0,1 н. раствором NaOH при рН 9,0-9,5 в течение 24-36 ч, осаждением ацетоном и лиофилизацией с дополнительной очисткой целевого продукта ультрафильтрацией через фильтр с пределом молекулярного удержания 5 кД. Технический результат: повышение активности целевого продукта. 6 табл.

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и касается получения биологически активных веществ из сырья животного происхождения, стимулирующих антигеннезависимую дифференцировку В-лимфоцитов.

Известен способ получения гемолимфопоэтических ростковых факторов из супернатанта культуры клеток костного мозга (патент США N 5264418, МКИ⁵ C 07 K 3/20, 1993), включающий ионообменную хроматографию на DEAE-целлюлозе, Con-A аффинную хроматографию, гель-фильтрацию на Sephacryl S-300, ионообменную хроматографию на mono-Q колонке, гель-фильтрацию на Superose 12. Получаемое вещество (HLGF-1) обладает способностью стимулировать дифференцировку пре-В клеток. Однако, данный способ является сложным многостадийным процессом, требующим большого количества реактивов и специального оборудования, процесс требует длительного времени, а препарат активен лишь в концентрации от 5 до 10 мг/мл. Конечный продукт имеет белковую природу с ММ 110-140 кД, что придает веществу дополнительные аллергогенные свойства.

Известен способ получения вещества, стимулирующего созревание B-лимфоцитов, из ткани сумки Фабрициуса птиц (авторское свидетельство СССР N 1438044, МКИ⁵ A 61 K 39/00, 1985), который по технической сущности и достигаемому эффекту является наиболее близким к предлагаемому решению и является его прототипом.

Согласно известному способу сумки Фабрициуса птиц замораживают при -40^oC, гомогенизируют и загружают в реактор с охлаждением и мешалкой в 3%-ный раствор уксусной кислоты (1 часть сырья к 5 частям раствора уксусной кислоты) и добавляют хлорид цинка из расчета 1 г на 1 л 3% уксусной кислоты (pH 3,5-4,0). Экстракцию проводят в течение 72 ч при 4-10^oC. Экстракт отфильтровывают, центрифугируют (5000 об/мин в течение 20 мин) и приливают в охлажденный ацетон в соотношении 1:5 (1 часть экстракта к 5 частям ацетона). Формирование осадка продолжается 24 ч при (-5)-(-8)^oC. Осадок отфильтровывают под вакуумом и отмывают чистым ацетоном. Раствор препарата стерилизуют фильтрацией, разливают в стерильные флаконы и лиофилизируют. Получают вещество, стимулирующее созревание B-лимфоцитов.

Однако данный способ позволяет получить вещество, обладающее низкой биологической активностью. Так, вещество, полученное по способу-прототипу, стимулировало созревание B-лимфоцитов в культуре клеток лишь в концентрации 100 мкг/мл. Кроме того, молекулярная масса данного вещества колеблется от 2000 до 12000 Д, что указывает на присутствие большого количества примесных соединений, не несущих специфической активности.

Данное изобретение направлено на повышение активности препарата. Решение поставленной задачи достигается тем, что экстракцию сырья проводят 0,1 н. раствором гидроксида натрия при pH 9,0-9,5 в течение 24 – 36 часов, а целевой продукт дополнительно очищают ультрафильтрацией с пределом молекулярного удержания 5 кД.

Способ осуществляется следующим образом.

Используемые в качестве сырья сумки Фабрициуса птиц получают на птицефабрике при разделке цыплят-бройлеров, причем забор сырья вписывается в технологическую цепочку забоя. Полученное сырье подвергают трехкратному замораживанию при температуре -40^oC, чередующимся с оттаиванием. Свежезамороженное сырье гомогенизируют в гомогенизаторе. Гомогенат заливают 0,1 н. раствором NaOH в объемном соотношении 1:5 (1 часть сырья и 5 частей раствора) и доводят pH смеси до 9,0 – 9,5. Экстракцию проводят при температуре 4 – 8^oC в течение 24 – 36 часов при постоянном перемешивании. По окончании экстракции смесь нейтрализуют добавлением 0,1 н. раствора соляной кислоты. Экстракт фильтруют через бязевую ткань, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. К фильтрату добавляют охлажденный ацетон в соотношении 1:5 (1 часть супернатанта и 5 частей ацетона). Формирование осадка продолжается в течение 24 часов при температуре (-5)-(-8) С. Осадок фильтруют под вакуумом, отмывают чистым ацетоном и высушивают на воронке Бюхнера. Порошок растворяют в дистиллированной воде и подвергают ультрафильтрации через фильтр с пределом молекулярного удержания 5 кД. Фильтрат разливают в стерильные флаконы и лиофилизируют. Полученное вещество стимулирует антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Берут 300 г свежезамороженных сумок Фабрициуса птиц, гомогенизируют в гомогенизаторе с добавлением физиологического раствора хлористого натрия. Гомогенат заливают 5 объемами 0,1 н. раствора NaOH, доводят pH смеси до 9,0. Экстракцию проводят в течение 24 часов при температуре 4^oC при постоянном перемешивании. Затем экстракт фильтруют через бязевую ткань, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут. К полученному экстракту добавляют охлажденный до -6^oC ацетон в соотношении 1:5 (1 часть экстракта и 5 частей ацетона), осадок формируют в течение 24 часов при температуре -6^oC. Полученный осадок отфильтровывают под вакуумом, тщательно промывают чистым ацетоном и высушивают. Порошок растворяют в 10 объемах дистиллированной воды, перемешивая в течение 1 часа, и подвергают ультрафильтрации на мембране Millipore (США) с пределом молекулярного удержания 5 кД. Выход активного вещества составил 2,4 г. При инкубации с лимфоцитами полученное вещество в концентрации 2 мкг/мл повышало количество B-лимфоцитов с lg-рецепторами до 340,9% (контроль 22,7 1,1%).

Пример 2. 1 кг сумок Фабрициуса птиц подвергают трехкратной заморозке при -40^oC, затем измельчают в гомогенизаторе с добавлением физиологического раствора хлористого натрия. Гомогенат заливают 5 объемами 0,1 н. раствора NaOH, доводят pH смеси 0,1 н. раствором соляной кислоты до 9,5. Экстракцию проводят в течение 36 часов при температуре 6^oC при постоянном перемешивании. Затем экстракт фильтруют через бязевую ткань, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут. К полученному экстракту добавляют охлажденный до -8^oC ацетон в соотношении 1:6(1 часть экстракта и 6 частей ацетона), осадок формируют в течение 24 часов при температуре -8^oC. Полученный осадок отфильтровывают под вакуумом, тщательно промывают трехкратным объемом чистого ацетона и высушивают. Порошок растворяют в 10 объемах дистиллированной воды при перемешивании в течение 1 часа и подвергают ультрафильтрации на мембране Millipore (США) с пределом молекулярного удержания 5 кД. Выход активного вещества составил 8,5 г. При инкубации с лимфоцитами полученное вещество в концентрации 2 мкг/мл повышало количество B-лимфоцитов с lg-рецепторами до 31 1,2% (контроль 22,7 1,1%).

Полученное вещество представляет собой комплекс пептидов с молекулярной массой до 5000 Д. Пептидная природа вещества, полученного по предлагаемому способу, подтверждается следующими данными:
1) Дает цветную реакцию с биуретовым реактивом;
2) Молекулярная масса компонентов, определенная с помощью гель-хроматографии, составляет 600-5000 Д;
3) Аминокислотный анализ вещества показал, что в состав полученного продукта входит 20 аминокислот в определенном соотношении;
4) Основной спектр (пик) поглощения в ультрафиолетовом свете колеблется в пределах 220-230 нм (спектрофотометрически).

Вышеуказанное позволяет достаточно точно провести идентификацию полученного вещества.

При сопоставительном анализе заявляемого способа и способа-прототипа выявлены следующие сходные признаки:
1) Оба способа предназначены для получения вещества, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов;
2) В качестве исходного сырья используют сумки Фабрициуса птиц;
3) Сырье предварительно замораживают;
4) Сырье гомогенизируют;
5) Гомогенат подвергают экстракции;
6) Экстракт фильтруют и центрифугируют;
7) Осаждение целевого продукта производят охлажденным ацетоном в течение 24 часов при (-5)-(-8)^oC;
8) Осадок отфильтровывают под вакуумом;
9) Полученное вещество лиофильно высушивают.

Однако известный способ-прототип и предлагаемый способ имеют следующие отличия:
1) В прототипе экстракцию проводят в 3% растворе уксусной кислоты при pH 3,0-3,5 с добавлением хлористого цинка в концентрации 1 г/л, а в предлагаемом способе экстракцию осуществляют 0,1 н. раствором NaOH при pH 9,0-9,5, что ведет к преимущественному выделению пептидов кислой природы;
2) В способе-прототипе время экстракции составляет 48 – 72 часа, а в предлагаемом способе экстракцию осуществляют в течение 24-36 часов;
3) В предлагаемом способе с целью дополнительной очистки целевого продукта осадок подвергают ультрафильтрации с пределом молекулярного удержания 5 кД;
4) В способе-прототипе целевой продукт представлен щелочными полипептидами с молекулярной массой от 2 до 12 кД, а в предлагаемом способе выделяют пептиды преимущественно кислой природы с ММ от 600 до 5000 Д.

Доказательство правильности выбранных в предлагаемом способе параметров экстракции и ультрафильтрации приведены в таблицах 2-4. Количество B-лимфоцитов, несущих lg-рецепторы, определяли методом прямой антиглобулиновой розеточной реакции с антисыворотками к иммуноглобулинам человека (Кудрявцева Е.Р., 1983). Концентрация пептидов в опыте составляла 2 мкг/мл.

Из таблицы 2 видно, что для получения вещества, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, необходимо проводить экстракцию при pH 9,0 – 9,5. Более высокие или более низкие значения pH приводят к снижению специфической активности получаемого вещества.

Из таблицы 3 видно, что оптимальное время экстракции составляет 24 – 36 часов. Уменьшение или увеличение времени экстракции приводит к снижению активности целевого продукта.

Из таблицы 4 видно, что максимальной специфической активностью обладает фракция с молекулярной массой до 5000 Д.

Биологическую активность полученного вещества, как и в способе-прототипе, изучали методом прямой антиглобулиновой розеточной реакции с антисыворотками к иммуноглобулинам человека (Кудрявцева Е.Р., 1983). Известно, что lg-рецепторы являются маркером дифференцировки B-клеток и экспрессируются на зрелых B-лимфоцитах. Лимфоциты периферической крови больных с ожогами IIIб – IV степени 15 – 30% поверхности тела инкубировали в течение 2 часов при температуре 37^oC в полной питательной среде с полученными пептидами в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл. Исследование проводили на лимфоцитах ожоговых больных, поскольку известно, что при ожоговой болезни нарушается антигеннезависимая дифференцировка B-лимфоцитов и в периферической крови появляется большое количество незрелых или “нулевых” клеток (Эберт Л.Я., 1980). В качестве контроля использовали лимфоциты, инкубированные с добавлением аналогичного объема физиологического раствора.

Кроме того, изучали влияние полученного вещества на экспрессию дифференцировочных антигенов CD21 и CD22, являющихся маркером зрелой B-клеткн – завершающего этапа антигеннезависимой дифференцировки B-лимфоцитов, методом непрямой поверхностной иммунофлуоресценции.

Таким образом, по предлагаемому способу получают вещество, обладающее стимулирующим действием на антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов. По сравнению со способом-прототипом предлагаемый способ позволяет достигнуть повышения активности целевого продукта, что выражается в снижении активной концентрации препарата. Так вещество, полученное по предлагаемому способу, обладает специфической активностью в концентрации от 0,5 до 10 мкг/мл, в то время как по способу-прототипу – 100 мкг/мл. Более того, полученные пептиды повышают количество B-лимфоцитов, несущих на своей мембране рецептор к C3d-компоненту комплементу (CD21). Подобным действием вещество, получаемое по способу-прототипу, не обладает.

Вещество, стимулирующее антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, может найти применение в медицине для профилактики и лечения иммунодефицитных состоянии различной этиологии с преимущественным поражением гуморального звена иммунитета.

Формула изобретения

1. Способ получения вещества, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку В-лимфоцитов из ткани сумки Фабрициуса птиц, включающий гомогенизацию предварительно замороженного сырья с последующей экстракцией, фильтрацией, осаждением ацетоном и лиофилизацией, отличающийся тем, что экстракцию проводят 0,1 н раствором NaOH при pH 9,0 – 9,5 в течение 24 – 36 ч, а целевой продукт дополнительно очищают ультрафильтрацией с пределом молекулярного удержания 5 кД.

РИСУНКИ

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.05.2001

Номер и год публикации бюллетеня: 2-2003

Извещение опубликовано: 20.01.2003