Патент на изобретение №2268298
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ТЕСТ-НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И ПЕРВИЧНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии и может быть использовано при индивидуальном подборе лекарственных препаратов для лечения туберкулеза. Тест-набор на основе среды Левенштейна-Йенсена состоит из 8 флаконов. Четыре флакона из которых дополнительно содержат противотуберкулезные препараты, первый флакон – изониазид, второй флакон – рифампицин, третий – стрептомицин, четвертый – этамбутол. Следующие два флакона, один из которых дополнительно содержит салицилат натрия, а другой – тиофенкарбоксигидразид. Другие два флакона являются контрольными. Набор дополнительно содержит один флакон с реактивом Грисса. Изобретение позволяет ускорить определение лекарственной чувствительности и проводить одновременно их идентификацию. 4 табл.
(56) (продолжение): CLASS=”b560m”A1, 18.06.1979. SU 575888 A1, 30.06.1979. SU 325879 A1, 16.04.1973. SU 260099 A1, 08.02.1973. SU 731904 A1, 30.05.1980.
Изобретение относится к медицинской микробиологии, касается производства диагностических препаратов и может быть использовано при индивидуальном подборе лекарственных препаратов для лечения туберкулеза. В практических лабораториях России для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза в основном используют среду Левенштейна-Йенсена лабораторного приготовления с добавлением противотуберкулезных препаратов, рекомендованную к применению Приказом МЗ РФ №109 (Приложение 11. Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза) [1]. Однако использование этой среды позволяет получить данные о лекарственной чувствительности возбудителя лишь через 3-5 недель. Кроме этого среды лабораторного приготовления являются нестандартными, что приводит к получению недостоверных результатов. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является набор для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза «Mycobiogramme» производства французской фирмы «BioMerieux» [2], состоящий из пробирок со средой Левенштейна-Йенсена следующего состава, г/л:
с добавлением противотуберкулезных препаратов в концентрациях, мкг/мл:
Определение лекарственной чувствительности микобактерий с использованием набора-прототипа проводят визуально по наличию видимого роста. Этот процесс длительный и занимает от 14 до 28 дней, что значительно осложняет своевременную корреляцию проводимого больному этиотропного лечения. Помимо этого набор – дорогостоящий и недоступен большинству практических лабораторий России. Задачей настоящего изобретения является создание тест-набора для ускоренного определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с их одновременной первичной идентификацией по появлению красной окраски. Поставленная задача решается тем, что разработан тест-набор для определения лекарственной чувствительности и первичной идентификации микобактерий туберкулеза на основе среды Левенштейна-Йенсена с добавлением противотуберкулезных препаратов, отличающийся тем, что набор состоит из 8 флаконов со средой Левенштейна-Йенсена, дополнительно содержащей нитрат натрия или нитрат калия в концентрации 0,6-1,2 г/л, а крахмал – в растворимой форме в концентрации 15,0-20,0 г/л, при этом четыре флакона, предназначенные для определения лекарственной чувствительности, дополнительно содержат противотуберкулезные препараты, первый флакон – изониазид в концентрации 1 мкг/мл, второй флакон – рифампицин в концентрации 40 мкг/мл, третий – стрептомицин в концентрации 10 мкг/мл, четвертый – этамбутол в концентрации 2 мкг/мл, два флакона, предназначенные для первичной идентификации микобактерий туберкулеза, один из которых дополнительно содержит салицилат натрия в концентрации 1000 мкг/мл, а другой – 2-тиофенкарбоксигидразид в концентрации 2 мкг/мл, два флакона являются контрольными, и дополнительно набор содержит один флакон с реактивом Грисса для регистрации результатов по появлению красной окраски. Предлагаемый тест-набор по сравнению с прототипом характеризуется короткими сроками 2-7 суток определения лекарственной чувствительности микобактерий по появлению красной окраски, возможностью в эти же сроки провести идентификацию микобактерий. Это достигается за счет 1) введения в среду Левенштейна-Йенсена крахмала в растворимой форме, что улучшает ростовые свойства среды, повышает скорость роста микобактерий, сокращает сроки учета результатов и не влияет на критические концентрации противотуберкулезных препаратов (табл.1, 2), 2) введения в среду нитрата натрия или калия, а в состав тест-набора реактива Грисса, что позволяет провести учет результатов по появлению красной окраски, не дожидаясь видимого роста микобактерий на среде. 3) использования в составе тест-набора одного флакона с салицилатом натрия и одного флакона с 2-тиофенкарбоксигидразидом, совокупность которых позволяет провести первичную идентификацию анализируемой культуры микобактерий (табл.3).
Пример 1. Приготовление питательной среды. Навески ниже перечисленных ингредиентов питательной среды:
растворяют в указанной последовательности в 375 мл дистиллированной воды при подогревании, не доводя до кипения, и стерилизуют в автоклаве 20 мин при температуре 121°С. После охлаждения к основе питательной среды добавляют 625 мл яичной массы, фильтруют. Пример 2. Питательную среду готовят, как описано в примере 1, но ингредиенты, отличающие среду от среды Левенштейна-Йенсена: калия нитрат и крахмал в растворимой форме, используют в следующих концентрациях:
Пример 3. Питательную среду готовят, как описано в примере 1, но натрия нитрат и крахмал в растворимой форме, используют в следующих концентрациях:
Пример 4. Приготовленную питательную среду в соответствии с примерами 1, 2, 3 разливают поровну в восемь стерильных колб. В шесть колб вносят при перемешивании один из следующих препаратов: изониазид – 0,125 мг, рифампицин – 5 мг, стрептомицин – 1,25 мг, этамбутол – 0,25 мг, натрия салицилат – 125 мг, 2-тиофенкарбоксигидразид (ТКГ) – 0,25 мг для получения конечных концентраций изониазида – 1 мкг/мл, рифампицина – 40 мкг/мл, стрептомицина – 10 мкг/мл, этамбутола – 2 мкг/мл салицилата натрия – 1000 мкг/мл, ТКГ – 2 мкг/мл. Затем содержимое всех восьми колб разливают в стерильные флаконы и проводят термокоагуляцию. Тест-набор комплектуют в соответствии с составом:
Хранение тест-набора осуществляют в темном месте при температуре 2-8°С не более 5 месяцев. Пример 5. Определение лекарственной чувствительности культур микобактерий проводят параллельно на предлагаемом тест-наборе и на наборе-прототипе. На тест-наборе дополнительно осуществляют первичную идентификацию микобактерий туберкулеза. Определение лекарственной чувствительности и первичную идентификацию микобактерий туберкулеза осуществляют методом, основанным на способности микобактерий туберкулеза восстанавливать нитраты в нитриты. Нитраты легко определяются с помощью реактива Грисса, который вызывает появление красной окраски. Определение лекарственной чувствительности микобактерий с использованием набора-прототипа осуществляют методом пропорций по наличию видимого роста. Восемь флаконов с питательными средами предлагаемого тест-набора засевают культурами микобактерий туберкулеза в соответствии с Приказом МЗ РФ №109. Пробирки с питательными средами набора-прототипа засевают в соответствии с инструкцией по применению. Учет результатов на прототипе проводят через 14-28 суток инкубирования посевов по наличию визуального роста микобактерий, на предлагаемом тест-наборе – через 2-7 суток по изменению окраски путем внесения реактива Грисса в виде водного 7,5% раствора реактива Грисса в количестве 0,5 мл или в сухом виде в количестве нескольких кристалликов в каждый из 8 флаконов тест-набора. Культура считается чувствительной к противотуберкулезному препарату, если во флаконе с данным препаратом не происходит появления красной окраски (при интенсивной окраске в контрольном флаконе). Культура считается устойчивой при появлении красной окраски во флаконе с противотуберкулезным препаратом. Первичную идентификацию микобактерий туберкулеза проводят по появлению красной окраски во флаконе с ТКГ и отсутствию красной окраски во флаконе с салицилатом натрия. Нетуберкулезные микобактерии, обладающие способностью восстанавливать нитраты в нитриты, вызывают одновременное появление красной окраски во флаконах и с салицилатом натрия, и с ТКГ. Результаты испытаний трех примеров тест-набора получились идентичными и представлены в таблицах 3,4.
Данные, представленные в таблицах, позволяют охарактеризовать исследуемые культуры, как штамм М. tuberculosis H37Ra, чувствительный к четырем лекарственным препаратам; клинический изолят М. tuberculosis 135, устойчивый к изониазиду, рифампицину, стрептомицину, этамбутолу; клинический изолят М. tuberculosis 138, устойчивый к изониазиду, а также М. kansasii 413, устойчивый к изониазиду, стрептомицину, этамбутолу и М. fortuitum 12, устойчивый ко всем четырем противотуберкулезным препаратам, что полностью совпадает с результатами, полученными на наборе-прототипе.
Из приведенных данных видно, что использование предлагаемого тест-набора приводит к сокращению сроков определения лекарственной чувствительности микобактерий до 2-7 суток по отношению к 14-28 суткам на наборе-прототипе при 100% совпадении результатов. Кроме определения лекарственной чувствительности предлагаемый тест-набор позволяет провести дополнительно первичную идентификацию микобактерий туберкулеза. Предлагаемый тест-набор нетрудоемок и удобен в использовании, не требует дополнительного оборудования и специальной подготовки персонала, и что немаловажно, дешев, а по срокам определения лекарственной чувствительности приближается к автоматизированным системам типа ВАСТЕС. Разработана технология и организовано производство промышленного изготовления тест-набора в удобной упаковке для транспортировки и последующей работы. Промышленное производство с осуществлением входного контроля сырья и контроля конечного продукта позволяет производить стандартные недорогие тест-наборы. Проведены клинические испытания тест-набора в пяти регионах страны при исследовании около 1000 клинических изолятов микобактерий туберкулеза, получены положительные результаты. Оформлен пакет научно-технической документации на производство тест-набора, который находится на утверждении в Фармакопейном комитете. Использование во фтизиобактериологических лабораториях предлагаемого тест-набора промышленного изготовления позволит ускорить определение лекарственной чувствительности микобактерий, увеличить надежность получаемых результатов, а также даст возможность получать сравниваемые данные по регионам для точной оценки эпидемической ситуации в стране. А удобная форма выпуска в герметично закрытых флаконах и достаточный срок хранения позволяет доставлять и использовать тест-наборы в самых отдаленных регионах страны. Источники информации 1. О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации. Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.03 г. 2. Culture Media Manual, bio Merieux, 1994 Edition.
Формула изобретения
Тест-набор для определения лекарственной чувствительности и первичной идентификации микобактерий туберкулеза на основе среды Левенштейна-Йенсена с добавлением противотуберкулезных препаратов, отличающийся тем, что набор состоит из 8 флаконов со средой Левенштейна-Йенсена, дополнительно содержащей нитрат натрия или нитрат калия в концентрации 0,6-1,2 г/л, а крахмал – в растворимой форме в концентрации 15,0-20,0 г/л, при этом четыре флакона, предназначенные для определения лекарственной чувствительности, дополнительно содержат противотуберкулезные препараты, первый флакон – изониазид в концентрации 1 мкг/мл, второй флакон – рифампицин в концентрации 40 мкг/мл, третий – стрептомицин в концентрации 10 мкг/мл, четвертый – этамбутол в концентрации 2 мкг/мл, два флакона, предназначенные для первичной идентификации микобактерий туберкулеза, один из которых дополнительно содержит салицилат натрия в концентрации 1000 мкг/мл, а другой – 2-тиофенкарбоксигидразид в концентрации 2 мкг/мл, два флакона являются контрольными, и дополнительно набор содержит один флакон с реактивом Грисса для регистрации результатов по появлению красной окраски.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
+ – наличие красной окраски во флаконах