Патент на изобретение №2267532

(54) КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ А4 Т-ЛИМФОБЛАСТНОГО ЛЕЙКОЗА ЧЕЛОВЕКА, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ СКРИНИНГА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и экспериментальной онкологии и может быть использовано для скрининга противоопухолевых препаратов, в частности для скрининга синтетических и природных веществ с потенциальной противоопухолевой активностью, а также для препаратов, противоопухолевый эффект которых не связан с индукцией апоптоза опухолевых клеток. Методом искусственной стимуляции апоптоза СD95-позитивных клеток действием эффекторных анти-СD95 моноклональных антител получена генетически и фенотипически стабильная клеточная линия, в полной мере сохраняющая гистогинетический фенотип Т-клеточного лимфобластного лейкоза, но не экспрессирующая рецептор CD95(Fas/APO-1). 6 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и экспериментальной онкологии и может быть использовано для скрининга противоопухолевых препаратов, в частности для скрининга синтетических и природных веществ с потенциальной противоопухолевой активностью, а также для препаратов, противоопухолевый эффект которых не связан с индукцией апоптоза опухолевых клеток.

При первичном отборе синтетических и природных веществ с потенциальной противоопухолевой активностью широко используется их тестирование на линиях опухолевых клеток in vitro.

Использование панелей многообразных по генетическим и фенотипическим признакам клеточных линий дает возможность максимально эффективного скрининга синтетических соединений, природных веществ и физических воздействий на предмет поиска их биологической активности на клеточном и молекулярном уровнях. Противоопухолевая активность большинства лекарственных средств связана с их способностью индуцировать в клетках-мишенях программированную гибель клеток (апоптоз). Одним из направлений в противоопухолевой химиотерапии является разработка препаратов синтетического и природного происхождения, избирательно индуцирующих апоптоз.

Открытие трансмембранного CD95(Fas/APO-1) рецептора и его лиганда (CD95L) позволило по-новому взглянуть на молекулярные механизмы лекарственно-индуцированного апоптоза. Предполагается, что CD95 рецепторно-лигандная система является критическим компонентом лекарственно-индуцированного апоптоза [1, 2]. Взаимоотношения компонентов сигнальных путей CD95/CD95L- и лекарственно-индуцированного апоптоза может иметь не только фундаментальное, но и практическое значение в разрешении проблемы резистентности опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам. Поэтому изучение возможной роли СD95(Fas/АРО-1)-рецепторно-лигандной системы в лекарственно-индуцированном апоптозе является актуальной и перспективной задачей в поиске новых методов и средств противоопухолевой терапии.

Известны CD95-дефицитные клеточные линии, резистентные к CD95-индуцированному апоптозу, но не резистентные к противоопухолевым препаратам [3, 4].

Известны также линии, обладающие устойчивостью к отдельным препаратам, как, например:

– цисплатин-резистентная эпидермальная линия карциномы человека – KB/DDP5 [5];

– доксорубицин-резистентная линия клеток лейкоза человека HL-60 [6];

– адриамицин-резистентный вариант клеток линии миелобластного лейкоза человека (K562/ADM) [7].

Однако известные линии не обладают фенотипом множественной лекарственной устойчивости, которым обладает линия А4, в связи с чем они не могут быть использованы для одновременного скрининга синтетических соединений и природных веществ с потенциальной противоопухолевой активностью, в том числе и тех, противоопухолевый эффект которых не связан с индукцией апоптоза опухолевых клеток.

Задачей изобретения явилось создание модельной клеточной линии, дефицитной по экспрессии рецептора сигнала клеточной смерти CD95 для расширенного поиска и скрининга веществ с потенциальной противоопухолевой активностью и веществ, противоопухолевый эффект которых не связан с индукцией апоптоза опухолевых клеток.

Заявляемая клеточная линия А4 Т-лимфобластного лейкоза человека хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур (Института цитологии РАН) под номером РККК (П) 682Д.

Клеточную линию А4 получали следующим образом.

В качестве основы использовали линию клеток Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat, клон Е6-1) [8]. Клетки родительской линии Jurkat (далее Jurkat/WT) имеют воспроизводимый иммунофенотип Т-лимфобластного лейкоза и экспрессируют трансмембранный рецептор сигнала клеточной смерти CD95(Fas/APO-1).

Суспензионную культуру линии Т-лимфобластных клеток человека Jurkat выращивали в питательной среде RPMI-1640, содержащей дополнительно 10 мМ HEPES, L-глутамин, гентамицин и 10% эмбриональной сыворотки теленка, в 24-луночном культуральном планшете (10⁵ клеток в 1 мл) в атмосфере 5% СО₂ в воздухе, при 37°С. Через 12 ч культивирования в лунки вносили моноклональные антитела (МКА) IPO-4 до их дробно понижающейся конечной концентрации: 1000, 500, 250, 125, 63, 31, 16, 8 и 4 нг/мл соответственно. Через 24 ч инкубации с МКА в лунках А1 и А2 (1000 и 500 нг/мл МКА) практически все клетки погибли или находились в состоянии развивающегося апоптоза, в лунках A3 и А4 (250 и 125 нг/мл МКА) сохранилась популяция выживших клеток (30 и 50% соответственно), в остальных лунках количество погибших и погибающих клеток снижалось пропорционально понижению концентрации МКА. Клетки из лунок A3 и А4 были переведены в свежую питательную среду без МКА для восстановления устойчивого роста. В течение 20 дней культивирования рост клеток из лунки А4 восстановился, и в дальнейшей работе использовалась именно эта культура (далее – А4). Культуру А4 вновь инкубировали 24 ч в среде с МКА IPO-4, повысив их концентрацию (250 нг/мл); далее – три недели в среде без антител. Третий и четвертый циклы селекции выполнены аналогично, но концентрация МКА в среде составляла 500 нг/мл.

Таким образом, методом искусственной стимуляции апоптоза (програмированной клеточной гибели) CD95-позитивных клеток действием эффекторных анти-СD95 моноклональных антител нами получена генетически и фенотипически стабильная клеточная линия, в полной мере сохраняющая гистогенетический фенотип Т-лимфобластного лейкоза человека, но не экспрессирующая рецептор CD95(Fas/APO-1).

Клетки полученной СD95-дефицитной линии А4 стабильно воспроизводят приобретенный иммунофенотип на протяжении 3 лет культивирования in vitro (более 1000 генераций).

Характеристика СD95-дефицитной линии А4.

Полученная СD95-дефицитная линия А4, сохраняющая в полной мере иммунологический фенотип, обладает рядом качеств, существенно отличающих ее от родительской линии Jurkat/WT.

Доля экспрессии CD95+клеток линии А4 составляет в среднем 7±3%, в противоположность родительской линии клеток Jurkat/WT, 65±14% клеток которой экспрессируют антиген CD95 (таблица 1).

Клетки линии А4 резистентны к СD95-индуцируемому апоптозу в отличие от клеток родительской линии Jurkat/WT (таблица 2).

Клетки линии А4 более резистентны к рентгеновскому облучению и жесткому УФ-свету (254 нм – диапазон УФ-С) в отличие от клеток родительской линии Jurkat/WT (таблица 3).

Клетки линии А4 устойчивы к оксидативному стрессу (к действию перекиси водорода, менадиона) (таблица 4).

Клетки линии А4 резистентны к индуцирующему апоптоз действию in vitro ряда цитотоксических противоопухолевых препаратов в терапевтических концентрациях (доксорубицин, этопозид, цисплатин, циклоплатам) (таблицы 5, 6).

Морфологические признаки. Клетки линии А4 морфологически сходны с клетками родительской линии Jurkat/WT – клетками лимфобластного типа.

Культуральные свойства. Культура суспензионного типа, со склонностью к межклеточной адгезии. Для наращивания биомассы клеток можно использовать культуральные флаконы. Во флаконы площадью 25 см² следует засевать 5.0-9.0×10⁵ клеток/мл. Пассирование через каждые два дня. Клетки линии А4 менее требовательны к условиям культивирования (уровень спонтанного апоптоза клеток А4 не превышает 5%, в то время как в тех же условиях 15-20% клеток «дикого типа» подвержены спонтанной гибели).

Клетки линии А4 способны длительное время (5 дней) оставаться без субкультивирования и смены среды.

Контаминация. Контаминантов не обнаружено. Тест на микоплазму отрицателен.

Кариотипическая характеристика. Модальное число хромосом – 46,

маркерная хромосома – Y.

Маркерные признаки. Экспрессия поверхностных антигенов – CD3, CD4, CD5, CD7, CD71, CD73; отсутствие экспрессии CD95, CD25. Клетки экспрессируют белки bcl-2, bcl-X_L, но не экспрессируют р53.

Криоконсервация. Клетки линии А4 ресуспендируют в эмбриональной телячьей сыворотке, содержащей 7,5% диметилсульфоксида (ДМСО), в концентрации 4-5×10⁶ клеток/мл, разливают в пластиковые ампулы, помещают в теплоизолирующий материал (пенополиуретан) и переносят в низкотемпературный холодильник при -70°С на 24 часа. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл безсывороточной среде и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего.

Скрининг противоопухолевых препаратов проводился двумя методами:

– определение апоптотических клеток по окрашиванию пропидий йодидом (PI) клеточных ядер, заключающийся в регистрации доли клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, что позволяет выявить количественный критерий интенсивности процесса апоптоза.

– МТТ-тест, позволяющий оценить цитотоксическое действие противоопухолевых препаратов. МТТ-тест основан на способности дегидрогеназ живых клеток превращать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5 дифенилтетразолий бромид (МТТ) в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде. Количество образовавшегося формазана (определяемое колориметрическим методом после его растворения в органических растворителях) характеризует интенсивность окилительно-востановительных процессов в клетках культуры и является косвенной характеристикой активной биомассы.

Определение апоптотических клеток линий Jurkat/WT и А4 после инкубации с противоопухолевыми препаратами по методу Nicoletti [9].

Клетки (5·10⁵ клеток в мл) одновременно засевают в 96-луночные плоскодонные планшеты и инкубируют с противоопухолевыми препаратами (доксорубицин, этопозид, цисплатин, циклоплатам) при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение 48 ч. Контролем служат интактные клетки, инкубированные в тех же условиях, но без препаратов.

Отмытые от среды культивирования клетки суспендируют в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Суспензию клеток (2,5·10⁵) суспендируют в охлажденном 70% этаноле в течение 1 часа и осаждают центрифугированием (7 мин, 500 об/мин). Осадок мягко суспендируют в 1,0 мл гипотонического раствора флюорохрома: 5 мкг/мл PI; 0,1% натрия цитрат; 0,1% Тритон Х-100 и инкубируют в темноте в течение 15 мин.

Суспензию окрашенных пропидий йодидом клеток анализируют на проточном цитофлюориметре FACSCalibur с аргоновым лазером (длина волны – 488 нм), с использованием программного обеспечения CELLQuest. Гистограммы строят на основании подсчета не менее 10 тысяч событий для каждого образца. Анализ гистограмм проводят с учетом интенсивности флюоресценции. Длина волны устанавливается в канале FL2 (563-607 нм) для красной флюоресценции (PI). Результаты представлены в таблице 5.

Как показывают результаты, представленные в таблице 5, через 48 ч инкубации клеток с противоопухолевыми препаратами клетки линии А4 практически не вступают в процесс апоптоза в отличие от клеток линии дикого типа Jurkat/WT.

Оценка цитотоксического действия противоопухолевых препаратов на клетки линий Jurkat/WT и А4 с помощью МТТ-теста [10].

Клетки в концентрации 5·10⁴ кл/мл засевают в 96-луночные плоскодонные планшеты и инкубируют с противоопухолевыми препаратами (доксорубицин, этопозид, цисплатин, циклоплатам) 24-48-72 ч. За 6 часов до окончания инкубации в каждую лунку вносили по 10 мкл раствора МТТ (1 мг/мл). По окончании инкубации клетки осаждают центрифугированием планшетов при 1000 об/мин в течение 2-3 мин. Супернатант осторожно отбирают, вносят в каждую лунку по 200 мкл ДМСО, клетки суспендируют и инкубируют 10 мин при 37°С, после чего немедленно определяют оптическую плотность раствора формазана в спектрофотометре при длине волны 540 нм. Результаты представлены в таблице 6.

Как следует из таблицы 6, клеточная линия Jurkat/WT более чувствительна к используемым препаратам (через 24 ч), тогда как уровень выживаемости клеток линии А4 остается на уровне интактного контроля (90-100%). Через 48 ч и 72 ч выживаемость клеток линии А4 уменьшается, но при этом значительно превышает выживаемость клеток линии Jurkat/WT.

Таким образом, полученная CD95-дефицитная линия А4 обладает рядом качеств, существенно отличающих ее от родительской линии Jurkat/WT:

– отсутствие экспрессии клетками этой линии антигена CD95 делает их полностью резистентными к индуцирующему апоптоз действию эффекторных моноклональных антител анти-СD95;

– одновременно клетки этой линии (в отличие от родительской) оказались резистентны к индуцирующему апоптоз действию in vitro ряда цитотоксических противоопухолевых препаратов;

– устойчивость к апоптоз-индуцирующим генотоксическим воздействиям коррелирует с полихимио- и радиорезистентностью клеток полученной CD95-дефицитной линии, обнаруженной по МТТ-тесту и по морфологии клеточных культур.

Технический результат.

Клеточная линия А4 Т-лимфобластного лейкоза человека, обладающая фенотипом множественной лекарственной и радиорезистентности, получена методом искусственной стимуляции апоптоза (программированной клеточной смерти) CD95-позитивных клеток действием эффекторных анти-CD95 моноклональных антител. Генетически и фенотипически стабильная клеточная линия А4 в полной мере сохраняет гистогинетический фенотип Т-клеточного лимфобластного лейкоза, но не экспрессирует рецептор CD95. Клетки полученной CD95-дефицитной линии воспроизводят приобретенный иммунофенотип на протяжении 3 лет культивирования in vitro.

Вышеуказанные свойства и результаты оценки специфического действия противоопухолевых препаратов с помощью полученной клеточной линии А4 позволяют использовать ее для одновременного расширенного скрининга и первичного отбора синтетических и природных веществ с потенциальной противоопухолевой активностью, изучать клеточные и молекулярные механизмы такой активности, а также использовать для тестирования препаратов, противоопухолевый эффект которых не связан с индукцией апоптоза опухолевых клеток.

Сравнительная характеристика иммунологического фенотипа клеточных популяций линий Jurkat/WT и А4.

Сравнительная характеристика CD95-индуцированного апоптоза клеток линий Jurkat/WT и А4

Сравнительная характеристика клеток линий Jurkat/WT и А4 к рентгеновскому облучению и жесткому УФ-свету.

Сравнительная характеристика влияния перекиси водорода и менадиона на клетки линий Jurkat/WT и А4. Долю апоптотических клеток выявляли по методу Nicoletti I.

Определение апоптотических клеток линий Jurkat/WT и А4 после инкубации с противоопухолевыми препаратами по методу Nicoletti I.

Оценка цитотоксического действия противоопухолевых препаратов клеток линий Jurkat/WT и А4 с помощью МТТ-теста

Список литературы.

9. Nicoletti I., Migliorati G., Pagliacci M.C., Grignani F., Riccardi C.A. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J. Immunol Methods; 1991. 139:271-280.

Формула изобретения

Клеточная линия А4 Т-лимфобластного лейкоза человека, дефицитная по антигену CD95(Fas/APO-l) с фенотипом множественной лекарственной и радиорезистентности для скрининга противоопухолевых препаратов in vitro, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур (Института цитологии РАН) под номером РККК (П) 682Д.