Патент на изобретение №2266544
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) УНИФИЦИРОВАННЫЙ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ И ЭКСТРАКЦИОННЫХ ПРЕПАРАТАХ ОЧАНКИ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области фармации, а именно к унифицированному способу количественного определения суммы флавоноидов в траве трех видов очанок: очанки коротковолосистой, очанки мелкоцветной, очанки Рейтера и экстракционных препаратах очанки коротковолосистой. Способ включает использование комплексообразующего агента – 2% спиртового раствора хлористого алюминия и ионизирующего агента – 8% спиртового раствора ацетата натрия; определение окрашенного комплекса методом дифференциальной спектрофотометрии при
Изобретение относиться к области фармации и касается количественного определения суммы флавоноидов в траве различных видов очанок и экстракционных препаратах очанки коротковолосистой. Растения рода Очанка (о.) – это однолетние, полупаразитные травы сем. Scrophulariaceae, имеющие трудно отличимые морфолого-анатомические признаки. Они используются в народной медицине и гомеопатии для лечения воспалительных и склеротических заболеваний глаз (катаракта, глаукома, конъюнктивит, блефарит), желудочно-кишечного тракта (гепатит, колит, энтероколит), верхних дыхательных путей (бронхит, ангина, пневмония) [Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их использование, семейства Caprifoliaceae – Plantaginaceae. – М.: Наука, 1990, С.139]. В ходе фитохимических исследований установлено, что основными группами действующих веществ травы о. коротковолосистой, о. мелкоцветной и о. Рейтера являются флавоноиды, иридоиды и фенолкарбоновые кислоты. Комплекс флавоноидных веществ этих растений представлен производными флавона – апигенином, лютеолином, цинарозидом [Сухинина Т.В. Фармакогностическое изучение растений рода очанка/Автореф. канд. дис. Пермь, 2002. 20 с.]. Фармакологические исследования экстракционных препаратов очанки показали наличие антимикробной, гипотензивной и противовоспалительной активности, сочетающейся с низкой токсичностью [Сухинина Т.В. Фармакогностическое изучение растений рода очанка/Автореф. канд. дис. Пермь, 2002. 20 с.]. Многолетний опыт использования в народной медицине и современные данные фармакологических исследований открывают перспективы внедрения травы очанки и экстракционных препаратов на ее основе в медицинскую практику. Однако разработка и промышленный выпуск препаратов травы очанки затруднен из-за возможной фальсификации и использования недоброкачественного сырья, отсутствия способов промежуточного технологического контроля и оценки качества конечных продуктов. Указанные трудности обусловлены отсутствием надежного способа количественного определения действующих веществ. Анализ патентной и научной литературы показал: прототип способа определения действующих веществ в траве различных видов очанок отсутствует. Об этом, в частности, свидетельствует отсутствие раздела определения действующих веществ в нормативно-технической документации на траву о. Ростковиуса и о. прямой в Германии [Deutschen Arcneimittel Codex, Stuttgart, 1997, A-192].
– в химическом составе растений; – в консистенции и структуре растительного материала; – в спектральных характеристиках; – в последовательности выполнения аналитических операций; – в используемых государственных стандартных образцах (ГСО). Целью настоящего изобретения является разработка унифицированного способа количественного определения, позволяющего определять сумму флавоноидов (действующих веществ): – в сырье различных видов очанок; – в водных извлечениях-настоях (1:10), сухих и жидких (1:2) экстрактах; – в спиртовых извлечениях – настойках (1:5), сухих и жидких (1:2) экстрактах, субстанции, содержащей комплекс флавоноидов (фракция флавоноидов). Для решения поставленной цели были решены следующие задачи: – выбран доступный комплексообразующий реагент, позволяющий спектрально зафиксировать наличие флавоноидов в растениях и растительных препаратах путем образования устойчивого во времени комплексного соединения; – определен метод спектрального обнаружения флавоноидов с комплексообразующим реагентом; – выбрана аналитическая длина волны, позволяющая избирательно определять флавоноидные соединения; – подобран государственный стандартный образец для пересчета суммы флавоноидов и определен его удельный показатель поглощения (Е1% 1см) в условиях способа количественного определения; – определены оптимальные условия извлечения флавоноидов из сырья (экстрагент; соотношение сырья и экстрагента; время экстракции); – разработаны оптимальные условия количественного определения суммы флавоноидов в экстракционных препаратах очанки коротковолосистой (рабочая длина волны, навески, разведение); – проведена метрологическая характеристика способа количественного определения флавоноидов в сырье и экстракционных препаратах. Способ количественного определения основан на использовании реакции комплексообразования флавоноидов очанки с алюминия хлоридом (AlCl3) в присутствии натрия ацетата (CH3COONa), с последующим количественным определением этого комплекса методом дифференциальной спектрофотометрии. Дифференциальная спектрофотометрия предусматривает использование в качестве контроля испытуемый раствор без реактивов, что позволяет исключить влияние окрашенных и сопутствующих веществ, а также веществ, не образующих комплексов с реактивами. Хлористый алюминий хлорид является дешевым и доступным реагентом и используется в сочетании с ионизирующей добавкой – ацетатом натрия. Одновременное использование комплексообразующих и ионизирующих реагентов вызывает более значительное батохромное смещение полос поглощения флавоноидов очанки по сравнению с использованием только комплексообразующего реагента ( Для определения метода спектрального обнаружения и аналитической длины волны были изучены УФ-спектры спиртовых извлечений надземной части с корнями (далее травы) трех видов очанок – о. коротковолосистой, о. мелкоцветной и о. Рейтера и государственного стандартного образца (ГСО) цинарозида (ФС 42-3150-95). Установлено, что УФ-спектры исследованных видов очанок совпадают (табл.1), в качестве примера приведены спектры очанки коротковолосиситой (см. чертеж). Дифференциальная кривая поглощения (см. чертеж) представляет собой интегрированный спектр наложения комплекса флавоноидных веществ, содержащихся в очанке, имеет всего один максимум 382 нм и перекрывается с длинноволновой полосой ГСО цинарозида в присутствии хлористого алюминия и ацетата натрия. Так как интервал между максимумами дифференциального спектра поглощения и длинноволновой полосы поглощения стандартного образца не превышает половины полуширины полосы поглощения стандартного образца, то погрешность измерения будет не значительной [Ловцева Е.А. Совершенствование способов контроля качества лекарственных средств производных пурина N-гликозидной структуры/Автореф. канд. дис., Пятигорск, 1993. 20 с.]. Это дает возможность использовать Для изучения возможности использования разработанного способа количественного определения флавоноидов в анализе экстракционных препаратов о. коротковолосистой были изучены их дифференциальные УФ-спектры с хлористым алюминием и ацетатом натрия (табл.2). Как следует из полученных данных, максимумы дифференциальных кривых совпадают, что позволяет использовать При разработке оптимальных условий извлечения флавоноидов из сырья использовали воду и этанол различной концентрации. Наиболее полное извлечение определяемых веществ достигалось при экстрагировании 80%-ным этанолом при соотношении сырья и экстрагента 1:80. Время полной экстракции флавоноидов 20 мин. Дальнейшее увеличение времени экстракции нецелесообразно, так как происходит значительное снижение суммы флавоноидов в исследуемых экстрактах. Данные условия извлечения одинаковы для сырья трех видов очанок – о. коротковолосистой, о. мелкоцветной и о. Рейтера. В качестве примера приведены результаты исследования травы очанки коротковолосистой (табл.3). Для пересчета содержания суммы флавоноидов в траве очанки на цинарозид нами рассчитан (табл.4) удельный показатель поглощения (Е1% 1см) комплексов растворов ГСО цинарозида и с хлористым алюминием и ацетатом натрия при аналитической длине волны 382 нм, который составляет 357,4±3,4. В связи с этим в формулу расчета нами включено теоретическое значение Е1% 1см=357, позволяющее не использовать в методике ГСО цинарозида. Унифицированный способ количественного определения суммы флавоноидов подтверждается следующими примерами. Пример 1. Определение суммы флавоноидов в траве о. коротковолосиситой, о. мелкоцветной и о. Рейтера. Аналитическую пробу воздушно-сухого сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито по ГОСТ 214-83 с отверстиями диаметром 2 мм. Около 0,6 г (точная навеска) сырья помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл со шлифом, прибавляют 50 мл 80%-ного этанола. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, считая с момента закипания экстрагента. Колбу охлаждают до комнатной температуры, извлечение фильтруют через ватный тампон в плоскодонную мерную колбу вместимостью 50 мл и через этот же фильтр доводят объем раствора 80%-ным этанолом до метки. Полученное извлечение фильтруют в плоскодонную колбу через бумажный фильтр (раствор А), первые 10 мл фильтрата отбрасывают. 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 1 мл 2%-ного спиртового раствора алюминия хлорида и 1 мл 8%-ного спиртового раствора ацетата натрия, доводят объем раствора до метки 80% этанолом и перемешивают (раствор Б). Спустя 30 мин измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 382 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 1 мл раствора А, доведенного 80%-ным этанолом до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл. Содержание суммы флавоноидов в сухой надземной части с корнями очанки в пересчете на цинарозид вычисляют по формуле: где D – оптическая плотность исследуемого раствора; m – навеска сырья, г; V – объем раствора А, взятого для разбавления, мл; 50 – объем раствора А, мл; 50 – объем раствора Б, мл; W – потеря в массе при высушивании сырья, %; 357 – удельный показатель поглощения комплекса цинарозида с реактивами при длине волны 382 нм. Статистическая обработка результатов количественного определения выполнена по общепринятой методике ГФ-XI [Государственная фармакопея СССР, XI изд., M., 1987, 4.1, 336 с.]. Результаты (табл.5) показали, что ошибка единичного определения с достоверной вероятностью 95% находиться в пределах 4,5-5,5%. Проверка на отсутствие систематической ошибки, путем добавки ГСО цинарозида к навеске сырья, выполнена на траве о. коротковолосистой. Установлено, что систематическая ошибка разработанного способа отсутствует (табл.6). Пример 2. Определение суммы флавоноидов в настоях (1:10) очанки коротковолосистой. 1 мл настоя помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 1 мл 2%-ного спиртового раствора алюминия хлорида и 1 мл 8%-ного спиртового раствора ацетата натрия, доводят объем раствора до метки 80% этанолом и перемешивают (раствор А). Спустя 30 мин измеряют оптическую плотность раствора А на спектрофотометре при длине волны 382 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 1 мл настоя, доведенного 80%-ным этанолом до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл. Содержание суммы флавоноидов в настоях очанки коротковолосистой в пересчете на цинарозид вычисляют по формуле: где D – оптическая плотность исследуемого раствора; а – навеска настоя, мл; 50 – объем раствора А, мл; 357 – удельный показатель поглощения комплекса цинарозида с реактивами при длине волны 382 нм. Пример 3. Определение суммы флавоноидов в жидком спиртовом экстракте (1:2) очанки коротковолосистой. 1 мл жидкого спиртового экстракта помещают в плоскодонную мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора 80%-ным этанолом до метки. Полученное разведение фильтруют в плоскодонную колбу через бумажный фильтр (раствор А), первые 10 мл фильтрата отбрасывают. 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 1 мл 2%-ного спиртового раствора хлористого алюминия и 1 мл 8%-ного спиртового раствора ацетата натрия, доводят объем раствора до метки 80% этанолом и перемешивают (раствор Б). Спустя 30 мин измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 382 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 1 мл раствора А, доведенного 80%-ным этанолом до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл. Содержание суммы флавоноидов в жидком спиртовом экстракте (1:2) очанки коротковолосистой в пересчете на цинарозид вычисляют по формуле: где D – оптическая плотность исследуемого раствора; а – навеска сырья, г; V – объем раствора А, взятого для разбавления, мл; 25 – объем раствора А, мл; 50 – объем раствора Б, мл; 357 – удельный показатель поглощения комплекса цинарозида с реактивами при длине волны 382 нм. Пример 4. Определение суммы флавоноидов в сухом спиртовом и сухом водном экстракте очанки коротковолосистой. Около 0,1 г (точная навеска) сухого спиртового или водного экстракта, помещают в плоскодонную мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют и доводят объем раствора 80%-ным этанолом до метки. Полученное разведение фильтруют в плоскодонную колбу через бумажный фильтр (раствор А), первые 10 мл фильтрата отбрасывают. 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 1 мл 2%-ного спиртового раствора хлористого алюминия и 1 мл 8%-ного спиртового раствора ацетата натрия, доводят объем раствора до метки 80% этанолом и перемешивают (раствор Б). Спустя 30 мин измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 382 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 1 мл раствора А, доведенного 80%-ным этанолом до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл. Содержание суммы флавоноидов в сухом спиртовом и водном экстракте очанки коротковолосистой в пересчете на цинарозид вычисляют по формуле: где D – оптическая плотность исследуемого раствора; а – навеска сырья, г; V – объем раствора А, взятого для разбавления, мл; 25 – объем раствора А, мл; 50 – объем раствора Б, мл; W – потеря в массе при высушивании сухого экстракта, %; 357 – удельный показатель поглощения комплекса цинарозида с реактивами при длине волны 382 нм. Пример 5. Определение суммы флавоноидов в субстанции, содержащей комплекс флавоноидов очанки коротковолосистой (фракция флавоноидов). Около 0,1 г (точная навеска) субстанции, содержащей сумму флавоноидов, помещают в плоскодонную мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют и доводят объем раствора 80%-ным этанолом до метки. Полученное разведение фильтруют в плоскодонную колбу через бумажный фильтр (раствор А), первые 10 мл фильтрата отбрасывают. 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 1 мл 2%-ного спиртового раствора хлористого алюминия и 1 мл 8%-ного спиртового раствора ацетата натрия, доводят объем раствора до метки 80% этанолом и перемешивают (раствор Б). Спустя 30 мин измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 382 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 1 мл раствора А, доведенного 80%-ным этанолом до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл. Содержание суммы флавоноидов в субстанции в пересчете на цинарозид вычисляют по формуле: где D – оптическая плотность исследуемого раствора; а – навеска субстанции, г; V – объем раствора А, взятого для разбавления, мл; 25 – объем раствора А, мл; 50 – объем раствора Б, мл; W – потеря в массе при высушивании субстанции, %; 357 – удельный показатель поглощения комплекса цинарозида с реактивами при длине волны 382 нм. Пример 6. Определение суммы флавоноидов в жидком водном экстракте (1:2) очанки коротковолосистой. 1 мл жидкого водного экстракта помещают в плоскодонную мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора 80%-ным этанолом до метки. Полученное разведение фильтруют в плоскодонную колбу через бумажный фильтр (раствор А), первые 10 мл фильтрата отбрасывают, 1 мл раствора А помещают мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 1 мл 2%-ного спиртового раствора алюминия хлорида и 1 мл 8%-ного спиртового раствора натрия ацетата, доводят объем раствора до метки 80% этанолом и перемешивают (раствор Б). Спустя 30 мин измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 382 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 1 мл раствора А, доведенного 80%-ным этанолом до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл. Содержание суммы флавоноидов в жидком водном экстракте очанки коротковолосистой в пересчете на цинарозид вычисляют по формуле: где D – оптическая плотность исследуемого раствора; а – навеска жидкого водного экстракта, мл; V – объем раствора А, взятого для разбавления, мл; 25 – объем раствора А, мл; 50 – объем раствора Б, мл; 357 – удельный показатель поглощения комплекса цинарозида с реактивами при длине волны 382 нм. Статистическая обработка результатов количественного определения суммы флавоноидов в экстракционных препаратах приведена в табл.7. Как следует из полученных данных, ошибка единичного определения с достоверной вероятностью 95% находится в пределах от 0,49 до 2,65%. Таким образом, способ количественного определения суммы флавоноидов является унифицированным, так как позволяет проводить определение действующих веществ в сырье различных видов очанок и экстракционных препаратов очанки коротковолосистой по единой методике, при этом отличие в анализе заключается только в величине навесок и степени их разведения до фотометрируемого раствора (табл.8). Разработанный способ может быть использован в фармацевтической и медицинской промышленности для стандартизации сырья трех видов очанок и экстракционных препаратов очанки коротковолосистой по содержанию действующих веществ (флавоноидов), проведения технологического контроля за производством. Литература Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их использование, семейства Caprifoliaceae – Plantaginaceae. – M.: Наука, 1990, с.139. Сухинина Т.В. Фармакогностическое изучение растений рода очанка/Автореф. канд. дис., Пермь, 2002. 20 с. Deutschen Arcneimittel Codex, Stuttgart, 1997, A-192. Кабишев К.Э., Саканян Е.И. Количественное определение суммы флавоноидных соединений в интраназальных лекарственных формах препарата Ловцева Е.А. Совершенствование способов контроля качества лекарственных средств производных пурина N-гликозидной структуры/ Автореф. канд. дис., Пятигорск, 1993. 20 с. Государственная фармакопея СССР, XI изд., М., 1987, T.I, 336 с.
Формула изобретения
1. Унифицированный способ количественного определения флавоноидов в траве и экстракционных препаратах очанки, характеризующийся тем, что в аналитической реакции используют совместно комплексообразующий агент – 2%-ный спиртовый раствор алюминия хлорида и ионизирующий агент – 8%-ный спиртовый раствор натрия ацетата; оптическую плотность окрашенного комплекса определяют методом дифференциальной спектрофотометрии при 2. Унифицированный способ количественного определения по п.1, отличающийся тем, что для определения суммы флавоноидов в траве очанки коротковолосистой, очанки мелкоцветной и очанки Рейтера берут 0,6 г измельченного сырья и экстрагируют 80%-ным этиловым спиртом, в соотношении сырье : экстрагент 1:80 в течение 20 мин; разводят исходное извлечение до соотношения навеска : спектрофотометрируемый раствор 0,6:2500. 3. Унифицированный способ количественного определения по п.1, отличающийся тем, что для определения суммы флавоноидов в настоях очанки коротковолосистой берут навеску 1 мл и разводят ее до соотношения навеска : спектрофотометрируемый раствор 1:50. 4. Унифицированный способ количественного определения по п.1, отличающийся тем, что для определения суммы флавоноидов в жидком спиртовом экстракте очанки коротковолосистой берут навеску 1 мл и разводят ее до соотношения навеска : спектрофотометрируемый раствор 1:2500. 5. Унифицированный способ количественного определения по п.1, отличающийся тем, что для определения суммы флавоноидов в сухом спиртовом и сухом водном экстрактах в субстанции, содержащей комплекс флавоноидов, берут навеску 0,1 г и разводят ее до соотношения навеска : спектрофотометрируемый раствор 0,1:1250. 6. Унифицированный способ количественного определения по п.1, отличающийся тем, что для определения суммы флавоноидов в жидком водном экстракте берут навеску 1 мл и разводят ее до соотношения навеска : спектрофотометрируемый раствор 1:1250.
РИСУНКИ
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 25.12.2006
Извещение опубликовано: 20.02.2008 БИ: 05/2008
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
= 382±2 нм; использование для расчета суммы флавоноидов удельного показателя поглощения Е1% 1см = 357 ГСО цинарозида и серии разведений, индивидуальных для каждого экстракционного препарата. Технический результат: способ позволяет проводить стандартизацию лекарственного сырья и экстракционных препаратов очанки по содержанию действующих веществ (флавоноидов) и может использоваться при разработке нормативно-технической документации. 5 з.п. ф-лы, 8 табл., 1 ил. 
Оксофил
