Патент на изобретение №2266126

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии приготовления пробиотических бактериальных препаратов для профилактики болезней животных. Проводят раздельное выращивание в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, Rhuminococcus albus Kr, из Bacillus subtilis – Bacillus subtilis B-8130. Причем Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Кг выращивают на жидкой питательной среде, состоящей из рубцовой жидкости, шрота подсолнечникового, мясопептонного бульона, хлористого натрия, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия, сульфата аммония и карбоната кальция и воды при заданном соотношении компонентов в течение 4-6 суток при температуре 37-40°С до достижения титра каждым из микроорганизмов 1·10⁸-3·10⁸. Штамм Bacillus subtilis B-8130 выращивают в жидкой питательной среде, состоящей из дрожжей, мелассы, шрота подсолнечникового, глютена, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия и хлористого кальция, и воды при заданном соотношении компонентов, доводя до рН – 7,2-7,4, в течение 4-6 суток при температуре 37-45°С до достижения титра Bacillus subtilis B-8130 1·10⁸-2·10⁸. Затем культуральные жидкости микроорганизмов объединяют при следующих соотношениях, мас.%: Культуральная жидкость микроорганизмов Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr 45-55, Культуральная жидкость микроорганизмов Bacillus subtilis B-8130 45-55. Способ повышает эффективность профилактики и лечения животных и птицы, сочетающего противомикробную защиту организма со стимулирующим воздействием на него, при одновременном увеличении конверсии корма с высоким содержанием клетчатки и расширении ассортимента лечебно-профилактических препаратов природного происхождения. 5 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии приготовления бактериальных препаратов для профилактики болезней животных.

Известна кормовая добавка, содержащая смесь живых молочнокислых бактерий и дицитроборатоксихинолин в соотношении 5-20 к 1 по сухому весу (патент РФ №2136173, бюл. 25, опубл. от 10.09.99).

Однако недостатком указанной добавки наличие побочных эффектов за счет ввода в ее состав химического соединения, которое в ряде случаев способно вызвать дисбактериоз. Кроме того, пробиотическая активность у разных штаммов различается и трудно стандартизировать данный препарат.

Известен способ получения сухого пробиотического препарата, включающий выращивание в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина штаммов энтеробактерий, например Bifidobacterium globosum БФ-4 или Streptococcus fa’cium ВГНКИ – 27 в течение 12-15 ч, затем нативную культуральную жидкость охлаждают до температуры 15-20°С и концентрируют в 10-15 раз, полученную концентрированную биомассу отмывают 2,5-3,5%-ным раствором сахарозы или лактозы и обезвоживают при температуре минус 25-35°С. При этом концентрирование нативной культуральной жидкости проводят методом ультрафильтрации на полых волокнах или микрофильтрацией на плоских мембранах, или сепарированием в полупериодическом режиме работы (патент РФ №2065305, кл. А. 61 К 35/74, бюл. №23, опубл. 1996 г.).

Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, необходимость использования гидролизата казеина значительно удорожает препарат. Во-вторых, использование в качестве метода концентрирования ультрафильтрации на полых волокнах или микрофильтрации на плоских мембранах делает данный метод дорогостоящим и требующим больших капиталовложений и высокой подготовки персонала. Также обезвоживание значительно усложняет технологический процесс и, увеличивая стоимость, приводит одновременно к потере активности живых микроорганизмов, входящих в состав препарата. Кроме того, использование в качестве смешанной пробиотической культуры только двух видов бактерий делает эту смешанную популяцию неустойчивой, что снижает эффективность ее применения.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения пробиотика для ветеринарии, предусматривающий выращивание лактобактерий и культивирование на соево-печеночной среде в термостате при температуре 36-38°С, причем дополнительно выращивают чистые культуры Bacillus subtilis, Rhuminococcus albus, из лактобактерий Lactobacillus plantarum, культивирование проводят раздельно в течение 72 часов, после чего полученные культуральные жидкости смешивают в равных количествах (патент РФ №2084233, кл. 6 А 61 К 35/66, бюл. №20, 20.07.97 – прототип).

Однако в известном способе используется в качестве одного из компонентов пробиотического препарата Lactobacillus plantarum, который благодаря своим свойствам широко используется в силосовании зеленой массы растений, но мало используется для нормализации работы желудочно-кишечного тракта. Кроме того, в данном способе не указывается источник, откуда выделены используемые в препарате микроорганизмы, что не может обеспечивать высокую эффективность предлагаемого препарата. Следует отметить, что пробиотик, полученный по указанному способу, получится дорогостоящим для применения в животноводстве и птицеводстве, так как каждый вид микроорганизмов культивируется отдельно, что усложняет технологический процесс и требует дополнительного оборудования. Следует отметить, что такой препарат не может обладать комплексным действием: пробиотическим, антимикробным, иммуномодулирующим и располагать целлюлозолитической активностью.

Известные способы не позволяют получать эффективный препарат для профилактики и лечения животных и птицы, сочетающего противомикробную защиту организма со стимулирующим воздействием на него, при одновременном увеличении конверсии корма с высоким содержанием клетчатки при использовании дешевого сырья для получения препарата и упрошенной схемы производства.

Техническим решением задачи является сочетание противомикробного и стимулирующего эффекта препарата с одновременным увеличением конверсии корма с высоким содержанием клетчатки для повышения продуктивности животных и птицы, и расширение ассортимента лечебно-профилактических препаратов природного происхождения при использовании дешевого сырья для получения препарата и упрощенной схемы производства за счет совместного культивирование Lactobacillus acidophilus Scav. и Rhuminococcus albus.

Поставленная задача достигается тем, что способ получения жидкого пробиотического препарата включает в себя раздельное выращивание в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Lactobacillus, Rhuminococcus albus. Bacillus subtilis до заданного достижения титра каждого микроорганизма и смешивание полученных культуральных жидкостей, причем из микроорганизма Lactobacillus используют Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, из Rhuminococcus albus – Rhuminococcus albus Kr, из Bacillus subtilis – Bacillus subtilis B-8130, при этом Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr. выращивают на жидкой питательной среде состоящей из рубцовой жидкости, шрота подсолнечникового, мясо-пептонного бульона, хлористого натрия, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия, сульфата аммония и карбоната кальция при следующих соотношениях, масс %:

в течение 4-6 суток при температуре 37-40°С до достижения титра каждым из микроорганизмов 1·10⁸-3·10⁸, а микроорганизм Bacillus subtilis B-8130 выращивают в жидкой питательной среде состоящей из дрожжей, мелассы, шрота подсолнечникового, глютена, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия и хлористого кальция при следующих соотношениях, мас.%:

доводя до рН – 7,2-7,4, в течение 4-6 суток при температуре 37-45°С до достижения титра Bacillus subtilis B-8130 1·10⁸-2·10⁸, затем культуральные жидкости микроорганизмов объединяются при следующих соотношениях, мас.%:

Заявленный способ получения жидкого пробиотического препарата отличается от прототипа соотношением микроорганизмов в нем, схемой совместного культивирования, составом питательной среды и видовым эпитетом Lactobacillus.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию “новизна”.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение поставленной задачи и не выявлены при изучении патентной и научно-технической литературы данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию “изобретательский уровень”.

Для получения жидкого пробиотического препарата смешивают между собой культуральные жидкости микроорганизмов Lactobacillus acidophilus Scav. В-4625, Rhuminococcus albus Kr и Bacillus subtilis B-8130. Причем микроорганизмы Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, Rhuminococcus albus Kr выращивают совместно на жидкой питательной среде, состоящей из рубцовой жидкости, шрота подсолнечникового, мясопептонного бульона, хлористого натрия, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия, сульфата аммония и карбоната кальция. Для оценки оптимального варианта питательной среды для выращивания данной клеточной суспензии провели опыты по их культивированию с различным составом и оценивали титр выросших микроорганизмов. Данные представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, оптимальным является вариант №3, так как в вариантах с меньшим содержанием солей титр микроорганизмов низкий, а увеличение концентрации соединений приводит к удорожанию питательной среды, без значительного увеличения содержания культивируемых микроорганизмов.

Температурой культивирования является интервал 37-40°С, а временем 37-40°С. Если температуру снизить ниже 37°С, тост культуры будет медленный, и она не достигнет необходимого титра за 5 суток. Если температура культивирования окажется выше 40°С, то рост культуры также будет снижаться, а ее дальнейшее повышением может привести к гибели микроорганизмов. Поэтому для достижения необходимого титра культурами оптимальным временем культивирования является 5 суток при температуре 38°С.

Микроорганизмы Bacillus subtilis B-8130, выделенные из слепых отростков кишечника глухаря, выращивают на жидкой питательной среде, состоящей из дрожжей, мелассы, шрота подсолнечникового, глютена, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия и хлористого кальция. Для оценки оптимального варианта питательной среды для выращивания данной клеточной суспензии провели опыты по их культивированию с различным составом и оценивали титр выросших микроорганизмов. Данные представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, оптимальным является вариант №3, так как в вариантах с меньшим содержанием солей количество микроорганизмов будет низкий, а увеличение концентрации соединений приводит к удорожанию питательной среды, без значительного увеличения содержания культивируемых микроорганизмов.

Температурой культивирования является интервал 37-45°С, а временем 4-6 суток. Если температуру снизить ниже 37°С, тост культуры будет медленный, и она не достигнет необходимого титра за 5 суток. Если температура культивирования окажется выше 45°С, то рост культуры также будет снижаться, а ее дальнейшее повышением может привести к гибели микроорганизмов. Поэтому для достижения необходимого титра культурами оптимальным временем культивирования является 5 суток при температуре 41°С.

Полученные, таким образом, суспензии микроорганизмов объединяют. Если внести в препарат Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr меньше 45%, то пробиотической активности препарата не будет, т.к. количество бактерий будет недостаточно, и целлюлозолитическая активность препарата не будет регистрироваться, т.к. количество бактерий будет недостаточно для эффективного процесса разрушения клетчатки. Если внести более 55% суспензии бактерий видов Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr, то антимикробный эффект не увеличивается, скорость разрушения клетчатки не увеличиться, так как субстрата для их развития будет недостаточно и поэтому нет необходимости вводить больше бактерий. Для того, чтобы эффективность препарата была оптимальной количество молочнокислых бактерий вида Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и целлюлозолитических бактерий Rhuminococcus albus Kr. должно составлять 50% от общего количества микроорганизмов в предлагаемом препарате. Если внести в препарат Bacillus subtilis B-8130 меньше 45%, то антимикробная и иммуностимулирующая активности препарата будут низкие, так как количество бактерий будет недостаточно. Если внести более 55%, то увеличение требуемого эффекта наблюдаться не будет. Для того, чтобы эффективность препарата была оптимальной, количество бацилл вида Bacillus subtilis B-8130 должно составлять 50%.

Пример конкретного осуществления способа получения влажного пробиотического препарата осуществлялся в ФГУ “Краснодарский биоцентр” г.Краснодар.

Выращивание бактериальных культур Lactobacillus acidophilus Scav. В-4625 и Rhuminococcus albus Kr осуществляют на жидкой питательной среде. В качестве питательной среды использовали состав, указанный ниже, на который после автоклавирования при 1 атм в течение 1 час, и охлаждения засевали чистую культуру микроорганизмов, методом смыва со кошеного агара:

Культивирование осуществляли в колбах для культивирования микроорганизмов объемом 3 литра без встряхивания в течение 5 суток при температуре 37-40°С до получения титра бактериальных клеток 2·10⁸ клеток/мл среды.

Одновременно культивируют Bacillus subtilis B-8130 на жидкой питательной среде. В качестве питательной среды использовали состав, указанный ниже, на который после автоклавирования при 1 атм в течение 1 час и охлаждения засевали чистую культуру микроорганизмов, методом смыва со кошеного агара:

Культивирование осуществляли в колбах для культивирования микроорганизмов объемом 3 литра без встряхивания в течение 5 суток при температуре 37-45°С до получения титра бактериальных клеток 1·10⁸ клеток/мл среды. Полученные таким образом культуральные жидкости объединяются стерильно в соотношении 1:1 по объему.

Промышленная эффективность пробиотического препарата полученного по предлагаемому способу иллюстрируется примерами.

Пример 1. Испытание препарата, полученного по предлагаемому способу, было проведено на птицефабрике “Кубань”, Усть-Лабинского района Краснодарского края в виде добавки при выращивании цыплят-бройлеров кросса “СК-Русь”. Схема опыта представлена в таблице 3.

Основные результаты оценки эффективности предлагаемого препарата в рационах цыплят-бройлеров с разным уровнем клетчатки представлены в таблице 4.

Как свидетельствуют данные таблицы 4, повышение уровня клетчатки в рационах бройлеров до 6% на финише, при применении предлагаемого препарата, позволило получить вполне удовлетворительные результаты сравнимые с контролем, где уровень клетчатки не повышался выше 4,8% на финишном рационе. Таким образом, предлагаемый препарат позволяет значительно изменить структуру рационов для цыплят-бройлеров, увеличивая ввод шротов из подсолнечника, что позволяет снизить стоимость кормов.

Пример 2. Научно-хозяйственный опыт на курах-несушках кросса УК-Кубань 123 был проведен на птицефабрике “Ново-Мышастовская”, Красноармейского района. Краснодарского края. Рацион контрольной и опытной групп состоят из кормов растительного происхождения, основу которых составили пшеница, ячмень, кукуруза, шрот подсолнечный, рисовая мучка, минеральные и витаминные добавки. В опытной группе добавляли препарат, полученный по предлагаемому способу, в расчете 2 кг на 1 тонну кормосмеси. Результаты опыта приведены в таблице 5.

Данные, приведенные в таблице, свидетельствуют, что предлагаемый пробиотический препарат увеличивает сохранность птицы, ее яйценоскость, снижая затраты кормов на 10 яиц и не ухудшая качества яиц.

Пример 3. Опыт на телятах проводился в АО им. М.Горького, Ленинградского района. Краснодарского края. Предлагаемый препарат применялся на поголовье телят. В контрольной и опытной группах было по 15 голов в возрасте 1-180 дней. Пробиотическая добавка вводилась в корм опытной группы в возрасте до 5 дней по 4 г в сутки на голову, а в дальнейшем в количестве 0,4% к сухому веществу рациона ежедневно в соответствии с “Временным наставлением по применению препарата пробиотического препарата”.

Анализируя данные опыта, можно отметить, что предлагаемый препарат ускорял формирование микрофлоры рубца, снижал заболеваемость опытных животных и повышал поедаемость грубых кормов. В опытной группе продуктивность животных (среднесуточные привесы) повысилась на 18-25%, сохранность – на 10%, расходов кормов снизился на 15% по сравнению с контрольной. Побочных действий и осложнений при применении предлагаемого препарата в рекомендованных дозах не установлено.

Пример 4. Опыт на откормочных свиньях проводился в АО “2-я пятилетка” Ленинградского района Краснодарского края. Предлагаемый препарат применялся на фоне рационов с высоким содержанием клетчатки. Результаты откорма свиней на рационах такого типа позволили получить приросты живой массы 550 г, что на 10 г хуже контроля. Однако стоимость 1 тонны таких комбикормов примерно на 350 рублей ниже контрольных. Таким образом, применение предлагаемого препарата при откорме свиней экономически оправдано.

Как показали результаты хозяйственных и научно-производственных испытаний по примерам 1, 2, 3, 4, полученный по заявляемому способу пробиотический препарат эффективно сочетает противомикробные и стимулирующие свойства при одновременном увеличении конверсии корма с высоким содержанием клетчатки за счет наличия целлюлозолитической активности, что выражается в более высокой продуктивности и повышенной сохранности в опытных группах животных и птицы в сравнении с контрольными группами во всех опытах.

Формула изобретения

Способ получения жидкого пробиотического препарата включает в себя раздельное выращивание в условиях глубинного культивирования микроорганизмов Lactobacillus, Rhuminococcus albus, Bacillus subtilis до заданного достижения титра каждого микроорганизма и смешивание полученных культуральных жидкостей, отличающийся тем, что из микроорганизма Lactobacillus используют Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625, из Rhuminococcus albus – Rhuminococcus albus Kr, из Bacillus subtilis – Bacillus subtilis B-8130, при этом Lactobacillus acidophilus Scav. B-4625 и Rhuminococcus albus Kr выращивают на жидкой питательной среде, состоящей из рубцовой жидкости, шрота подсолнечникового, мясо-пептонного бульона, хлористого натрия, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия, сульфата аммония и карбоната кальция при следующих соотношениях, мас.%:

в течение 4-6 суток при температуре 37-40°С до достижения титра каждым из микроорганизмов 1·10⁸-3·10⁸, а микроорганизм Bacillus subtilis В-8130 выращивают в жидкой питательной среде, состоящей из дрожжей, мелассы, шрота подсолнечникового, глютена, сульфата магния, двузамещенного фосфорнокислого калия и хлористого кальция при следующих соотношениях, мас.%:

доводя до рН – 7,2-7,4, в течение 4-6 суток при температуре 37-45°С до достижения титра Bacillus subtilis В-8130 1·10⁸-2·10⁸, затем культуральные жидкости микроорганизмов объединяют при следующих соотношениях, мас.%:

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 23.03.2006

Извещение опубликовано: 27.10.2007 БИ: 30/2007

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 10.12.2007

Извещение опубликовано: 10.12.2007 БИ: 34/2007

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 23.03.2008

Извещение опубликовано: 20.03.2009 БИ: 08/2009

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 27.10.2009

Извещение опубликовано: 27.10.2009 БИ: 30/2009

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования “Кубанский государственный аграрный университет”

НИЛ

Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью “Биотехагро”

Договор № РД0061108 зарегистрирован 01.03.2010

Извещение опубликовано: 10.04.2010 БИ: 10/2010

* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия