Патент на изобретение №2265656

(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ UREAPLASMA UREALYTICUM И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ УРЕАПЛАЗМОЗОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования Ureaplasma urealyticum и диагностики урогенитальных уреаплазозов путем выделения уреаплаз из клинического материала. Питательная среда Ureaplasma urealyticum содержит питательную основу, стимуляторы роста, цистеин, мочевину, феноловый красный, лошадиную сыворотку, селективные добавки и дистиллированную воду. В качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста – дрожжевой экстракт и среду 199, в качестве селективных добавок – антибиотики. Предложенный способ диагностики инфекций, вызываемых Ureaplasma urealyticum, включает введение питательной среды вышеоговоренного качественного и количественного состава компонентов, способствующей обнаружению возбудителей заболеваний в лунки культурального планшета, исследуемого материала и вещества, создающего анаэробные условия и анализ изменения цвета питательной среды. Способ диагностики прост в постановке, не требует специального оборудования, позволяет проводить как выявление, так и идентификацию возбудителей, определить степень обсемененности и спектр чувствительности к различным антибактериальным препаратам, оценить эффективность проведенного лечения. Использование питательной среды позволяет упростить состав, повысить скорость и точность способа диагностики уреаплазменной инфекции за счет повышения чувствительности среды. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культивирования Ureaplasma urealyticum и диагностики урогенитальных уреаплазозов, путем выделения уреаплаз из клинического материала.

Этиологическая структура урогенитальных инфекций постоянно меняется. В последнее время резко возросла частота хламидийной, вирусной, микоплазменной, уреаплазменной и смешанной инфекций, борьба с которыми представляет значительные трудности в связи с развивающейся устойчивостью к антибиотикам и особенностями ответных реакций организма.

Особый интерес представляют микоплазменные и уреаплазменные инфекции. Заболевания человека, вызываемые уреаплазмами, объединяют в группу уреаплазмозов человека. Человек является естественным хозяином одиннадцати видов микоплазм. Пять из них, в том числе Ureaplasma urealyticum, патогенны в полном соответствии с постулатами Коха.

Имеются убедительные доказательства этиологической роли уреаплазм при привычных абортах и преждевременных родах. Уреаплазменная инфекция верхних отделов генитального тракта приводит к воспалительным процессам, нарушающим репродуктивную функцию организма. Заселение уреаплазмами эндометрия в 50% случаев приводит к самопроизвольным абортам. Колонизация уреаплазмами фаллопиевых труб может вызвать сальпингит, приводящий к сужению просвета или даже к полной их непроходимости. Имеются данные о серологических подтвержденных случаях внутриутробной респираторной инфекции плода, вызванной уреаплазмами. Таким образом, очевидна необходимость специального обследования всех беременных женщин для выявления случаев урогенитального уреаплазмоза и последующей санации.

Наибольшую диагностическую ценность имеют методы выявления возбудителей и их антигенов. Указанное определяется рядом особенностей урогенитальных инфекций и их возбудителей: их широким распространением и длительностью циркуляции антител после перенесенной инфекции (особенно IgG-антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА)), наличием хронических и латентных форм, частыми микст-инфекциями, высокой серологической гетерогенностью и антигенной изменчивостью, широким спектром перекрестных серологических реакций, низкими титрами специфических иммуноглобулинов при локальных формах инфекций и др. Наиболее простым и надежным является культуральный метод диагностики урогенитальных инфекций.

Из патентной литературы известна “Питательная среда для выделения Ureaplasma urealyticum” Для приготовления среды в 1 л дистиллированной воды вносят, г/л: питательный бульон 20-27, экстракт кормовых дрожжей 3-8; цистин 0,1-0,2; мочевина 0,01-0,05; тиаминбромид 0,003-0,007; бромкрезоловый пурпурный 0,01-0,03 и калий фосфорнокислый 6-10. Смесь кипятят и стерилизуют. После стерилизации в остывшую среду вносят лошадиную сыворотку 150-250 г и амфотерицин В 30-70 ед. Среда имеет рН 5,4-5,8, чувствительность 10^-5 ЦИЕ/мл. (См. патент РФ №1495381, 1989)

Также известна “Питательная среда для выделения уреаплазм”. Готовят бульон из свежей плаценты, промытой водопроводной водой и освобожденной от оболочек. Плаценту нарезают небольшими кусочками, взвешивают, помещают в кастрюлю, заливают двойным количеством водопроводной воды и кипятят в течение 30 мин. Полученный бульон осветляют и стерилизуют автоклавированием. Берут плацентарного бульона 700-800 г/л, экстракта кормовых дрожжей 3,5-4,5 г/л гидролиза казеина 6-10 г/л, мочевины 0,5-10,0 г/л, лошадиной сыворотки 40-100 г/л, фенолового красного 0020-0025, доливают водой дистиллированной до 1 л. Устанавливают рН 6,0-6,2, разливают во флаконы и лиофильно высушивают. (См. патент РФ №1723128, С 12 Q 1/20, 1992).

Наиболее близким к заявляемому способу является “Способ подсчета, обнаружения и идентификации микоплазм в общем и урогенитальных микоплазм в частности, и биологическая среда, специально приспособленная для этой цели”. Способ характеризуется ферментативными реакциями, которые протекают при анаэробных условиях в жидкой среде для выращивания микоплазм, содержащей бульон для культивирования микоплазм, лошадиную сыворотку, ампициллин, бактрим, восстановитель тиогликолят натрия, дрожжевой экстракт, цистеин и аргинин. В качестве цветового индикатора используют феноловый красный. Для создания анаэробных условий, используют парафиновое масло. Анализируя изменение цвета индикатора в течение одного-двух дней делают выводы о наличии микоплазменной инфекции. (См. патент US №5091307, 1992).

Культуральный метод диагностики урогенитальных инфекций, для выявления Ureaplasma urealyticum на селективной жидкой питательной среде является наиболее простым и надежным. Использование этого метода позволяет осуществлять выявление и идентификацию Ureaplasma urealyticum, а также оценивать степень обсемененности исследуемого материала в цветообразующих единицах (ЦОЕ/мл). Последнее особенно важно для клинической оценки этиологии воспалительных процессов. Имеющим этиологическое значение считается концентрация уреаплазм в исследуемом материале не менее 10000 ЦОЕ/мл. Определение чувствительности выделенных культур к антибиотикам и целенаправленное назначение препаратов существенно повышает эффективность проводимой терапии, что выгодно отличает культуральный метод от других методов диагностики урогенитальных уреаплазмозов (полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции иммунофлюоресценции (РИФ)). Культуральный метод диагностики урогенитальных уреаплазмозов является более достоверным в сравнении с РИФ, более низкая чувствительность и специфичность которой определяется малыми линейными размерами этих микроорганизмов, выраженной их гетерогенностью и изменчивостью, часто встречающейся низкой концентрацией уреаплазм в первичном материале и, соответственно, необходимости их накопления для выявления, сложностью взятия качественного соскоба для этой реакции.

Разработана технология получения селективной питательной среды, что дает возможность проведения идентификации выделенных культур уреаплазм и оценки их количества (титра) в образцах. При разработке были получены оптимальные соотношения компонентов селективной жидкой питательной среды для выявления Ureaplasma urealyticum, что привело к повышению ее чувствительности.

Среда обеспечивает рост Ureaplasma urealyticum, сопровождающийся изменением цвета среды за счет проявления ферментативной активности, и тормозит рост сопутствующих грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов.

Питательная среда для выявления Ureaplasma urealyticum, содержит питательную основу, стимуляторы роста, цистеин, мочевину, феноловый красный, лошадиную сыворотку, селективные добавки и дистиллированную воду. Отличается тем, что, в качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста – дрожжевой экстракт и среду 199, в качестве селективных добавок – антибиотики; при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Питательная среда содержит селективные добавки – антибиотики при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

В предложенном составе питательной среды представлено оптимальное количественное соотношение компонентов, концентрация антибиотиков и индикаторного красителя. Предложенный способ диагностики инфекций, вызываемых Ureaplasma urealyticum, включает введение питательной среды, способствующей обнаружению возбудителей заболеваний в лунки культурального планшета, исследуемого материала и вещества, создающего анаэробные условия и анализ изменения цвета питательной среды. В качестве питательной среды используют:

питательную среду, содержащую питательную основу, стимуляторы роста, цистеин, мочевину, феноловый красный, лошадиную сыворотку, селективные добавки и дистиллированную воду, в качестве питательной основы – сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста – дрожжевой экстракт и среду 199, в качестве селективных добавок – антибиотики. Способ диагностики прост в постановке, не требует специального оборудования, позволяет проводить как выявление, так и идентификацию возбудителей, определить степень обсемененности и спектр чувствительности к различным антибактериальным препаратам, оценить эффективность проведенного лечения.

Использование заявляемого состава питательной среды позволяет упростить состав, повысить скорость и точность способа диагностики уреаплазменной инфекции за счет повышения чувствительности среды.

Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №237500, 2002 г.) – 18-24 г, триптозу (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211709, 2002 г.) – 8-12 г, дрожжевой экстракт (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211929, 2002 г.) – 3-4 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую (“Sigma”, кат. № М5017, 2002 г.) – 4,7-5,2 г, L-цистеина гидрохлорид (“Sigma”, США, кат. №8277, 2002 г.) – 0,1-0,15 г, мочевину (“Sigma”, США, кат. № U 4128, 2002 г.) – 0,4-0,6 г, феноловый красный (“Sigma”, США, кат. № Р 5530, 2002 г.) – 0,04-0,07 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием.

Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 250-300 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль – 0,5-1,0 г, ванкомицина гидрохлорид – 0,1-0,2 г, полимиксин В сульфат – 0,01-0,02 г, амфотерицин В – 0,01-0,02 г, линкомицина гидрохлорид – 0,02-0,03 г. Устанавливают рН 6,1-6,3.

Пример 1.

Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №237500, 2002 г.) – 18 г, триптозу (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211709, 2002 г.) – 8 г, дрожжевой экстракт (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211929, 2002 г.) – 3 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую (“Sigma”, кат. № М5017, 2002 г.) – 4,7 г, L-цистеина гидрохлорид (“Sigma”, США, кат. №8277, 2002 г.) – 0,1 г, мочевину (“Sigma”, США, кат. № U 4128, 2002 г.) – 0,4 г, феноловый красный (“Sigma”, США, кат. № Р 5530, 2002 г.) – 0,04 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием.

Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 250 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль – 0,5 г, ванкомицина гидрохлорид – 0,1 г, полимиксин В сульфат – 0,01-0,02 г, амфотерицин В – 0,01 г, линкомицина гидрохлорид – 0,02 г. Устанавливают рН 6,1-6,3.

Пример 2 (оптимальный).

Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №237500, 2002 г.) – 20 г, триптозу (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211709, 2002 г.) – 10 г, дрожжевой экстракт (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат, №211929, 2002 г.) – 3 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую (“Sigma”, кат. № М5017, 2002 г.) – 4,95 г, L-цистеина гидрохлорид (“Sigma”, США, кат. №8277, 2002 г.)- 0,125 г, мочевину (“Sigma”, США, кат. № U 4128, 2002 г.) – 0,5 г, феноловый красный (“Sigma”, США, кат. № Р 5530, 2002 г.) – 0,05 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием.

Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 250 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль – 0,75 г, ванкомицина гидрохлорид – 0,15 г, полимиксин В сульфат – 0,01-0,02 г, амфотерицин В – 0,015 г, линкомицина гидрохлорид – 0,025 г. Устанавливают рН 6,1-6,3.

Пример 3.

Для приготовления основы среды в 650 мл дистиллированной воды растворяют сердечно-мозговую вытяжку (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №237500, 2002 г.) – 24 г, триптозу (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211709, 2002 г.) – 12 г, дрожжевой экстракт (“Becton Dickinson microbiology systems”, США, кат. №211929, 2002 г.) – 4 г. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Отдельно в 100 мл дистиллированной воды растворяют среду 199 сухую (“Sigma”, кат. № М5017, 2002 г.) – 5,2 г, L-цистеина гидрохлорид (“Sigma”, США, кат. №8277, 2002 г.) – 0,15 г, мочевину (“Sigma”. США, кат. № U 4128, 2002 г.) – 0,6 г, феноловый красный (“Sigma”, США, кат. № P 5530, 2002 г.) – 0,07 г; полученный раствор добавок стерилизуют фильтрованием.

Для приготовления среды смешивают 650 мл основы среды, 100 мл раствора добавок и 300 мл лошадиной сыворотки. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют ампициллина натриевая соль – 1 г, ванкомицина гидрохлорид – 0,2 г, полимиксин В сульфат – 0,01-0,02 г, амфотерицин В – 0,02 г, линкомицина гидрохлорид – 0,03 г. Устанавливают рН 6,1-6,3.

Селективная питательная среда должна обеспечивать рост Ureaplasma urealyticum, сопровождающийся изменением цвета среды с желтого на красный за счет проявления уреазной активности, и тормозить рост сопутствующих микроорганизмов (грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов). Способ диагностики урогенитальных микроплазмозов.

1. Разморозить питательную среду при комнатной температуре или на водяной бане при температуре 40°С-45°С.

2. Внести по 0,225 мл питательной среды в 4 последовательные лунки культурального 96-луночного планшета (или 4 микропробирки на 1,5 мл или 0,5 мл), промаркировать лунки планшета (микропробирки): первую. – 3, вторую – 4, третью – 5, четвертую – 6.

3. Суспендировать на вортексе исследуемый образец.

4. Сделать серию 10-кратных разведений исследуемого образца в питательной среде: внести 0,25 мл исследуемого образца в лунку (микропробирку) 3, тщательно пипетировать, перенести 0,25 мл из полученного разведения в следующую лунку (микропробирку) и повторить процедуру разведения.

5. В 4 последовательные лунки культурального планшета (микропробирки), обозначенные “К-” внести по 0,200 мл питательной среды и провести процедуру 10-ти кратного разведения, как описано в п.4, используя вместо исследуемого образца транспортную среду.

6. В каждую лунку планшета (микропробирку) внести по 0,70 мл стерильного минерального масла для создания анаэробных условий.

7. Планшет (микропробирки) помещают в термостат и инкубируют при температуре (37±1)°С.

8. Регистрацию результатов проводят на третьи сутки инкубации в термостате при ежедневном визуальном просмотре посевов и о степени обсемененности материала судят по изменению цвета питательной среды.

В качестве транспортной среды используют среду при следующем соотношении ингредиентов,: г/л:

– среда 199 сухая (“Sigma”, кат. №М5017, 2002 г.) 4,7-5,2

Для проведения диагностики используется следующий клинический материал:

– соскоб клеток слизистой уретры, цервикального канала, влагалища;

– первая порция утренней мочи (осадок, полученный центрифугированием 10 мл первой порции утренней мочи);

– секрет предстательной железы (V – 0,50-0,10 мл), эякулят (V – 0,50-0,10 мл).

Ключевым моментом в диагностике возбудителей урогенитальных микоплазмозов являются взятие исследуемого материала и условия его хранения. Необходимо:

1) брать материал до начала проведения антибактериальной терапии;

2) процедура взятия материала должна быть стандартной;

3) важно получить достаточное количество клеток, поскольку уреаплазма является микроорганизмом, колонизирующим клеточную поверхность;

4) не использовать при взятии материала местных антисептиков;

5) тщательное удаление слизи из цервикального канала;

6) взятие уретральных образцов следует проводить не ранее чем через 2-3 – часа после мочеиспускания;

7) получение секрета предстательной железы и эякулята проводят непосредственно после мочеиспускания;

8) исследуемый материал помещают в специальную транспортную среду, наилучшим образом обеспечивающую сохранение жизнеспособности уреаплазм.

Учет результатов.

Учет результатов проводят путем визуального просмотра засеянных планшетов (пробирок). Рост Ureaplasma urealyticum наблюдается в течение 48-72 часов. Рост Ureaplasma urealyticum сопровождается изменением цвета питательной среды с желтого на красный, без помутнения, за счет проявления уреазной активности, образования аммиака и сдвига рН. Рост отмечается на вторые сутки инкубации. В случае низкой обсемененности материала изменение цвета среды происходит на третьи сутки.

Формула изобретения

1. Питательная среда для выявления Ureaplasma urealyticum, содержащая питательную основу, стимуляторы роста, цистеин, мочевину, феноловый красный, лошадиную сыворотку, селективные добавки и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста – дрожжевой экстракт и среду 199, в качестве селективных добавок – антибиотики при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

L-Цистеина гидрохлорид

2. Питательная среда по п.1, отличающаяся тем, что содержит селективные добавки – антибиотики при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

3. Способ диагностики инфекций, вызываемых Ureaplasma urealyticum, включающий введение питательной среды, способствующей обнаружению возбудителей заболеваний в лунки культурального планшета, исследуемого материала и вещества, создающего анаэробные условия, и анализ изменения цвета питательной среды, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют питательную среду, содержащую питательную основу, стимуляторы роста, цистеин, мочевину, феноловый красный, лошадиную сыворотку, селективные добавки и дистиллированную воду, в качестве питательной основы – сердечно-мозговую вытяжку и триптозу, в качестве стимуляторов роста – дрожжевой экстракт и среду 199, в качестве селективных добавок – антибиотики при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

вносят в лунки культурального планшета транспортную среду, маркируют лунки планшета; суспендируют на вортексе исследуемый образец материала, делают серию 10-кратных разведении исследуемого образца в питательной среде и повторяют процедуру разведения; в обозначенные контрольные лунки культурального планшета вносят питательную среду и проводят процедуру разведения с использованием транспортной среды; в каждую лунку планшета вносят стерильное минеральное масло, создающее анаэробные условия; планшет помещают в термостат и инкубируют при температуре (37±1)°С; регистрацию результатов проводят на третьи сутки инкубации в термостате при ежедневном визуальном просмотре посевов.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве транспортной среды используют питательную среду при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Общество с ограниченной ответственностью “ИнтерЛабСервис”

НИЛ

Лицензиат(ы): ФГУ науки “Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии” Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ЦНИИЭ РОСПОТРЕБНАДЗОРА)

Договор № РД0008468 зарегистрирован 28.04.2006

Извещение опубликовано: 10.06.2006 БИ: 16/2006

* ИЛ – исключительная лицензия НИЛ – неисключительная лицензия

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 23.03.2007

Извещение опубликовано: 20.02.2008 БИ: 05/2008

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.02.2010

Извещение опубликовано: 20.02.2010 БИ: 05/2010