Патент на изобретение №2265053

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИПСИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению протеолитических ферментов? и может быть использовано в медицине, ветеринарии и других отраслях. Способ предусматривает измельчение (гомогенизацию) поджелудочной железы в водопроводной воде без применения буферных растворов, экстракцию продукта, отделение балластных белков и липидов. Отделение балластных белков и липидов осуществляют путем добавления к гомогенату 1%-ного кислотного раствора хитозана, перемешивания, отстаивания. Фильтруют полученную смесь через бельтинг-ткань. Концентрируют трипсиносодержащий фильтрат методом ультрафильтрации через полые волокна и подвергают сушке. Изобретение позволяет увеличить выход трипсина, повысить специфическую его активность, упростить технологический процесс получения трипсина и сократить его продолжительность, повысить безопасность и экологическую чистоту производства. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а конкретно к технологии получения протеолитических ферментов, и может быть использовано в биологической промышленности при производстве культуральных вирусных вакцин, при работе с клеточными культурами, в медицине, ветеринарии и других отраслях промышленности.

Известен способ получения трипсина (1) – прототип, предусматривающий двухкратное размораживание и замораживание поджелудочной железы (ПЖ) от убойных животных в течение 12-16 часов, измельчение ПЖ, добавление воды и серной кислоты, выдерживание в течение 6 часов при 16-24°С при постоянном перемешивании, отделение экстракта путем центрифугирования с повторной экстракцией жмыха по описанной выше технологии, объединение полученных экстрактов с добавлением сернокислого аммония для осаждения балластных белков, отделяемых центрифугированием и утилизируемых. К трипсиносодержащей жидкости повторно добавляют сернокислый аммоний. Осадок трипсина отделяют на центрифуге, разводят водой и направляют на распылительную сушку. Выход готовой продукции с ПЖ составляет 1-1,5% (2).

Существенным недостатком этого способа является низкий выход готовой продукции (1-1,5%), многостадийность, трудоемкость, длительность технологических процессов и их сложность, трудность аппаратурного оформления и осуществления в промышленных условиях, загрязненность целевого продукта сернокислым аммонием, что отрицательно сказывается на качестве готового препарата, а также необходимость строительства очистных сооружений из-за загрязненности производства, не подлежащего утилизации сернокислым аммонием (1, 2).

Целью заявленного изобретения является увеличение выхода и повышение специфической активности трипсина, упрощение технологического процесса и сокращение его продолжительности, а также повышение безопасности и экологической чистоты производства.

Поставленная цель достигается тем, что технологический процесс получения трипсина включает измельчение (гомогенизацию) ПЖ, экстракцию готового продукта, отделение балластных белков и липидов путем добавления к гомогенату 1%-ного кислотного раствора хитозана из расчета 0,4-1,2 л на 1 кг ПЖ, перемешивание, отстаивание в течение 10-12 часов, фильтрацию полученной смеси через бельтинг-ткань, концентрирование трипсиносодержащего фильтрата методом ультрафильтрации через полые волокна, лиофилизацию или распылительное высушивание концентрата трипсина.

Пример 1 (получение трипсина с оптимальным количеством хитозана).

Для получения трипсина по предлагаемому способу 100 кг ПЖ от убойных животных размораживают при температуре 15-25°С и добавляют 200 л водопроводной воды. Полученную смесь подвергают измельчению на коллоидной мельнице. В гомогенат добавляют 1%-ный кислотный раствор хитозана в количестве 0,9 л на 1 кг ПЖ, включают механическую мешалку (180 об/мин) для перемешивания реакционной смеси до появления агломерированных частиц балластных веществ в виде белково-липидной фракции, перемешивание останавливают и реакционную смесь отстаивают в течение 10-12 часов. Отстоявшуюся смесь подвергают фильтрации для отделения сформировавшейся белково-липидной фракции, трипсинсодержащий раствор направляют на ультрафильтрацию для концентрирования трипсина. Полученный концентрат трипсина подвергают лиофильной сушке на ТГ – 50.

Выход готовой продукции из ПЖ составляет 12%. Специфическая активность трипсина по модифицированному методу Kunitz M. et al. (ФС 42-3008-99) составляет 10 ПЕ/г препарата.

Полученный трипсин представляет собой тонкодисперстный порошок белого или кремового цвета, без посторонних примесей со специфическим запахом.

Пример 2 (получение трипсина с минимальным количеством хитозана).

Получение трипсина осуществляют аналогично примеру 1, только 1%-ный кислотный раствор хитозана добавляют в количестве 0,4 л на 1 кг ПЖ. Выход готовой продукции из ПЖ составляет 8%, а специфическая активность трипсина по модифицированному методу Kunitz M. et al. (ФС 42-3008-99) составляет 8 ПЕ/г препарата.

Пример 3 (получение трипсина с максимальным количеством хитозана).

Получение трипсина осуществляют аналогично примеру 1, только 1%-ный кислотный раствор хитозана добавляют в количестве 1,2 л на 1 кг ПЖ. Выход готовой продукции из ПЖ составляет 10%, а специфическая активность трипсина по модифицированному методу Kunitz M. et al. (ФС 42-3008-99) составляет 9 ПЕ/г препарата.

Пример 4 (получение трипсина с нижеминимальным количеством хитозана).

Получение трипсина осуществляют аналогично примеру 1, только 1%-ный кислотный раствор хитозана добавляют в количестве 0,3 л на 1 кг ПЖ.

Выход готовой продукции из ПЖ составляет 6%, а специфическая активность по модифицированному методу Kunitz M. et al. (ФС 42-3008-99) составляет 5 ПЕ/г препарата.

Пример 5 (получение трипсина с вышемаксимальным количеством хитозана).

Получение трипсина осуществляют аналогично примеру 1, только 1%-ный кислотный раствор хитозана добавляют в количестве 1,3 л на 1 кг ПЖ. Выход готовой продукции из ПЖ составляет 10%, а специфическая активность по модифицированному методу Kunitz M. et al. (ФС 42-3008-99) составляет 9 ПЕ/г препарата.

Таким образом, увеличение добавления 1%-ного кислотного раствора хитозана свыше 1,3 л на 1 кг ПЖ не приводит к увеличению выхода и повышению специфической активности трипсина (табл.1)

Сравнительная характеристика физико-химических и биологических свойств трипсина, полученных по известному способу и предлагаемому изобретению приведены в таблице 2.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет значительно (в 8 раз) увеличить выход целевого продукта и повысить активность трипсина за счет более полного выделения целевого продукта из трипсиносодержащей жидкости, сократить продолжительность технологического процесса за счет исключения целого ряда стадий, повысить безопасность и экологическую чистоту производства за счет исключения из процесса применения сернокислого аммония. В технологическом процессе не используются спирты и другие пожаровзрывоопасные и загрязняющие окружающую среду вещества.

Источники информации

1. SU 1628526, А 1, кл. С 12 N 9/76 – (прототип).

2. Попова В.М. Усовершенствование технологии изготовления и изучение свойств трипсина сухого для вирусологических целей. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 1999, с.38, 166.

Формула изобретения

Способ получения трипсина, предусматривающий размораживание поджелудочной железы убойных животных, измельчение ее, экстракцию, отделение балластных белков и липидов, фильтрацию, концентрирование, высушивание и расфасовку целевого продукта, отличающийся тем, что перед измельчением в размороженную поджелудочную железу добавляют водопроводную воду, а экстракцию ведут обработкой гомогената 1%-ным кислотным раствором хитозана в количестве 0,4-1,2 л на 1 кг поджелудочной железы.