Патент на изобретение №2264825

(54) СПОСОБ ИНАКТИВАЦИИ SALMONELLA TYPHIMURIUM ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ ВАКЦИН

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Предложен способ инактивации Salmonella typhimurium. Способ включает выращивание культуры Salmonella typhimurium, отмывку стерильным 0,9% раствором NaCl (pH 7,0), обработку 10% водным раствором аммиака до конечной концентрации 1% и инкубирование смеси 5 часов, далее проводят центрифугирование суспензии сальмонелл, сливают надосадочную жидкость и ресуспензируют осадок стерильным 0,9% раствором NaCl (pH 7,0). Предложенный способ позволяет получать инактивированную культуру Salmonella typhimurium, которая при введении подкожно мышам не вызывает их гибели.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к методам инактивации микроорганизмов при изготовлении вакцин.

Исторически более ранними из всех вакцин являются живые вакцины. Сравнительно более поздними наблюдениями было установлено, что иммуногенными свойствами обладают не только живые, но и убитые микроорганизмы [1], [2].

Убитые вакцины получают нагреванием или используя другие методы физического и химического воздействия на микроорганизмы. Поэтому различают гретые, феноловые, формалиновые, спиртовые, ацетоновые вакцины. Могут быть применены ультрафиолетовое облучение, ультразвук и другие средства [1], [2].

Цель изобретения: разработка нового метода инактивации микроорганизмов при изготовлении вакцин, в частности, для специфической профилактики сальмонеллеза сельскохозяйственных животных.

Предлагаемый метод отличается от известных методов химического воздействия на микроорганизмы для получения убитых вакцин тем, что культуру сальмонелл обрабатывают 10%-ным водным раствором аммиака до конечной концентрации 1% в течение 5 часов с последующей отмывкой стерильным 0,9% раствором NaCl, pH 7,0 для удаления аммиака.

Щелочная среда и NH₃ ^– ионы, создаваемые раствором аммиака, приводят к нарушению метаболических процессов и разрыхлению клеточной стенки сальмонелл, что приводит к их гибели.

Способ инактивации Salmonella typhimurium при изготовлении вакцин выполняют следующим образом:

– культуру Salmonella typhimurium выращивают на МПА с использованием посевной дозы 3 млрд микробных клеток в течение 2-х суток при +37°С с последующей отмывкой стерильным 0,9% раствором NaCl (pH 7,0) и доведением концентрации до 100 млрд микробных клеток/мл;

– к полученной смеси сальмонелл добавляют 10% водный раствор аммиака до конечной концентрации 1%;

– смесь инкубируют в течение 5 часов в условиях термостата при +37°С;

– после экспозиции проводят центрифугирование суспензии сальмонелл при 5000 g в течение 15 минут;

– надосадочную жидкость сливают;

– осадок ресуспензируют стерильным 0,9% раствором NaCl (pH 7,0) с доведением концентрации сальмонелл до 4-100 млрд микробных клеток/мл.

Для контроля качества инактивации проводили высевы полученной суспензии сальмонелл на МПА в чашках Петри методом серийного разведения в 10^-5, 10^-3 и 10^-1 степени (по 2 чашки на каждое разведение).

Чашки Петри выдерживали в условиях термостата при 37°С в течение 8 суток. При этом рост сальмонелл на чашках Петри отсутствовал во всех испытуемых контрольных образцах (n=10)

Полученную микробную взвесь сальмонелл использовали в качестве средства для специфической профилактики сальмонеллеза па лабораторных животных. В качестве модели использовали белых мышей.

Белых мышей, отобранных по принципу аналогов, в количестве 15 голов в возрасте 5 недель живой массой 16-18 грамм (n=3) иммунизировали суспензией культуры сальмонелл Salmonella typhimurium, инактивированных 1% раствором аммиака. Вакцину вводили подкожно в дозе по 0,3 мл с содержанием 4 млрд микробных клеток сальмонелл в 1 мл двукратно с интервалом 7 дней.

У 5 вакцинированных белых мышей (n=3) через 14 дней после иммунизации брали кровь для проведения серологических исследований в реакции агглютинации (РА). В качестве антигена использовали суспензию бактерий из штамма Salmonella typhimurium согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике сальмонеллезов человека и животных [2]. Титры антител в РА у опытных мышей были в пределах 1:160-1:320 (++++), что свидетельствует о выработке поствакцинальных специфических антител.

Через 14 дней после вакцинации опытных мышей заражали вирулентной культурой сальмонелл Salmonella typhimurium внутрибрюшинно в дозе 200 LD₅₀ в объеме 0,3 мл с содержанием 3 млн микробных клеток/мл.

Параллельно заражали вирулентной культурой сальмонелл Salmonella typhimurium контрольную (интактную) группу белых мышей в количестве 10 голов внутрибрюшинно в дозе 0,3 мл с содержанием 3 млн микробных клеток/мл (200 LD₅₀).

При этом наблюдали гибель белых мышей контрольной группы на 3-5 день после заражения. Все мыши опытной группы, которым вводили подкожно суспензию культуры сальмонелл Salmonella typhimurium, инактивированной 1% раствором аммиака, выжили.

Полученные данные дают основания считать, что предлагаемый способ инактивации Salmonella typhimurium при изготовлении вакцин пригоден для изготовления вакцинных препаратов с целью специфической профилактики сальмонеллезов сельскохозяйственных животных.

Источники информации

1. Аркадьева З.А., Безбородов A.M., Блохина И.Н. и др. Промышленная микробиология: учеб. пособие для вузов. – М.: Высшая школа, 1989. – С.571.

2. Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды (методические указания). – М.: ВО “Агропромиздат”, 1990.

Формула изобретения

Способ инактивации Salmonella typhimurium при изготовлении вакцин, характеризующийся выращиванием культуры Salmonella typhimurium с последующей отмывкой стерильным 0,9%-ным раствором NaCl (pH 7,0), далее обрабатывают 10%-ным водным раствором аммиака до конечной концентрации 1% и инкубируют смесь в течение 5 ч, затем проводят центрифугирование суспензии сальмонелл, сливают надосадочную жидкость и ресуспензируют осадок стерильным 0,9%-ным раствором NaCl (pH 7,0).