Патент на изобретение №2264823

(54) СПОСОБ И ПЕПТИДЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЭРЕКТИЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ, СПОСОБ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННЫХ ПЕПТИДОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицинской фармакологии и может быть использовано для лечения эректильной дисфункции. Сущностью изобретения являются малые пептиды, которые могут быть охарактеризованы формулой: X-A-B-C-Y-NH₂, в которой Х – -аминоизобутирил, транексамил (т.е. 4-(аминометил)цикло-гексанкарбонил), изонипекотинил, -аминобутирил, водород или имидазолилацетил, А – D-2-метилтриптофан, D--(2-нафтил)аланин или D-триптофан, В – D-2-метилтриптофан, D--(2-нафтил)аланин, D-триптофан или отсутствует, С – D-2-метилтриптофан, фенилаланин или отсутствует, Y – лизин или аргинин, где D означает декстроизомер, или фармацевтически приемлемую соль пептида, вызывающие эрекцию полового члена. Также предложены фармацевтическая композиция, содержащая данные пептиды, и способы лечения эректильных дисфункций. Техническим результатом является получение средства для лечения эректильных дисфункций. 4 н. и 8 з.п. ф-лы.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к медицинской фармакологии и касается пептидов, которые могут вводиться с целью лечения эректильной дисфункции.

Уровень техники

Этиология эректильной дисфункции (ED) или импотенции является сложной и ее, как правило, делят на первичную или более распространенную вторичную дисфункцию.

Основной причиной ED является сосудистое нарушение, но другие распространенные причины включают гормональные нарушения, употребление наркотиков и неврологические нарушения.

Средства лечения ED могут быть разделены на центральные или периферические инициаторы, центральные или периферические кондиционирующие агенты и другие средства. В качестве подробного обзора по данной теме с обсуждением роли нейротрансмиттеров и нейропептидов см. статью A.Argiolas и M.R.Melis, Progress in Neurobiology, 47:235-255 (1995). В плане классификации способов лечения см. статью J.P.W. Heaton и соавт., Int. J. Impotence Research, 9:115-121 (1997).

Среди нейропептидов, обладающих центральным действием при индукции эрекции полового члена, наиболее известными являются пептиды ACTH/MSH и окситоцин. Однако данные пептиды с центральной активностью не имеют специфического действия и не могут быть использованы вследствие серьезных побочных эффектов.

Известно, что непептидильные продукты используют для лечения ED. Среди них алпростадил (PGE₁) применяют местно, а апоморфин и сильденафил вводят подъязычно или перорально. Все известные агенты имеют серьезные недостатки, такие как свойства вызывать рвоту (апоморфин) и сердечно-сосудистые побочные эффекты (сильденафил).

Пептиды для лечения эректильной дисфункции уже известны и описаны в патенте СА-А-2158425 (Competitive Tech Inc.), публикации заявки РСТ WO 94/22460 A (University Patents Inc.), патенте US-A 5214030 (Stief Georg) и статье Wessels H. и соавт. “Синтетический меланотропный пептид инициирует эрекции у мужчин с психогенными эректильными дисфункциями – перекрестное исследование двойным слепым методом с контролем плацебо” (Synthetic Melanotropic Peptide Initiates Erections in Men with Psychogenic Erectile Dycfunctions: Double-Blind, Placebo Controlled Crossover Study”), Journal of Urology, US, Baltimore, MD, т.160, август 1998, стр.389-393, ХР 002922952 ISSN: 0022-5347.

Заявка WO 97/22620 A (Deghenghi R.) включает пептиды общей формулы A-D-X-D-Mrp-B (при А=H, Aib, GAB, X=Mrp, В=C-Lys-NH₂ при В=Phe, Mrp). Отличием от общей формулы данной заявки является стереохимическая структура С-концевого Mrp в группе Mrp-Lys-NH₂.

В патентах US-A-5955421 (Deghenghi R.) и US-A-5932548 (Deghenghi R.), относящихся к предшествующему уровню техники, описаны пептид GAB-D-2-Mrp-D-2-Mrp-D-2-Mrp-Lys-NH₂ и его терапевтическое применение.

Очевидно, что требуется способ лечения, который является настолько специфическим, насколько это возможно, вызывает минимум побочных эффектов и является простым в применении.

Сущность изобретения

Данное изобретение касается неожиданного обнаружения того факта, что маленькие пептиды, которые не принадлежат ни к какому из ранее известных классов пептидов, влияющих на эрекции полового члена, могут вызывать эрекции полового члена у самцов животных при инъекции в паравентрикулярное ядро гипоталамуса или при системном (внутривенном или подкожном) введении таким животным.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В данном описании используют следующие сокращения: D – декстроэнантиомер, Aib – -аминоизобутирил, ТХМ – транексамил (т.е. 4-(аминометил)циклогексанкарбонил), INIP – изонипекотинил, GAB – -аминобутирил, IMA – имидазолилацетил, Mrp – 2-метил-Trp, -Nal – (2-нафтил)аланин, Trp – триптофан, Phe – фенилаланин, Lys – лизин, Arg – аргинин, Н – водород, NH₂ – концевой амид.

Пептиды, которые используют в данном изобретении, включают пептиды общей формулы:

X-A-B-C-Y-NH₂, в которой

Х – Aib, ТХМ, INIP, GAB, Н или IMA,

А – D-Mrp, D-Nal или D-Trp,

В – D-Mrp, D-Nal или D-Trp или отсутствует,

С – D-Mrp, Phe или отсутствует,

Y – Lys или Arg, где

nil указывает на отсутствие В и/или С.

Предпочтительные пептиды, соответствующие данному изобретению, включают в себя:

GAB-D-Mrp-D-Nal-Phe-Lys-NH₂,

GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂,

GAB-D-Mrp-D-Nal-Phe-Arg-NH₂ и

GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂.

Если это желательно, могут быть использованы любые фармацевтически приемлемые соли пептидов, соответствующих данному изобретению. Данные соли должны включать в себя без ограничения перечисленным соли, полученные при добавлении органических или неорганических кислот, такие как, например, гидрохлорид, гидробромид, фосфат, сульфат, ацетат, сукцинат, аскорбат, тартрат, глюконат, бензоат, малат, фумарат, стеарат и памоат.

Вышеупомянутые пептиды могут быть приемлемым образом получены согласно принятым способам химии пептидов путем твердофазного синтеза с использованием Fmoc-аминокислот (Fmoc – флуоренилметоксикарбонил), как описано в монографии Atherton и Sheppard “Твердофазный синтез пептидов” (“Solid Phase Peptide Synthesis”) (IRL Press, Oxford University Press, 1989) или в монографии J. Jones “Химический синтез пептидов” (Chemical Synthesis of Peptides”) (Clarendon Press, Oxford, 1994).

Твердофазный синтез начинают с С-конца пептида. Подходящий исходный материал может быть приготовлен, например, путем присоединения требующейся защищенной -аминокислоты к хлорметилированной смоле, гидроксиметилированной смоле, бензгидриламинной смоле (ВНА) или пара-метилбензгидриламинной смоле (п-Ме-ВНА). В качестве примера доступной хлорметилированной смолой является BIOBEADS^SM SX 1, производимая фирмой BioRad Laboratories, Richmond, California. Получение гидроксиметилированной смолы описано в работе Bodansky и соавт., Chem. Ind. (London) 38:15997 (1966). Смола ВНА описана Pietta и Marshall, Chem. Comm., 650 (1970) и выпускается в промышленном масштабе фирмой Peninsula Laboratories Inc., Belmont, California.

После начального присоединения защитную группу -аминокислоты можно удалить с помощью различных кислотных реагентов, содержащих трифторуксусную кислоту (ТФУ) или соляную кислоту (HCI), растворенную в органических растворителях, при комнатной температуре. После удаления защитной группы -аминокислоты оставшиеся защищенные аминокислоты могут быть постадийно присоединены в желаемом порядке. Конденсация каждой защищенной аминокислоты может быть, как правило, проведена в приблизительно трехкратном избытке с использованием подходящего агента, активирующего карбоксильную группу, такого как дициклогексилкарбодиимид (DCC) или диизопропилкарбодиимид (DIC), растворенного, например, в метиленхлориде (CH₂Cl₂), диметилформамиде (ДМФА) или их смесях. После завершения образования желаемой аминокислотной последовательности желательный пептид можно отщепить от смолы-носителя посредством воздействия такого реагента, как фторид водорода (HF), который отщепляет не только пептид от смолы, но также защитные группы боковых цепей. При использовании хлорметилированной смолы или гидроксиметилированной смолы обработка HF приводит к образованию пептида с концевой кислотой в свободной форме. При использовании смолы ВНА или р-Ме-ВНА обработка HF приводит непосредственно к образованию пептида с концевым амидом в свободной форме.

Вышеописанные пептиды могут быть введены системно, подъязычно, защечно, перорально, интраназально, внутрилегочно или внутриглазно в дозах, находящихся между 0,02 и 2 мг/кг массы тела, в соответствующим образом приготовленной форме с фармацевтически приемлемыми наполнителями, или в виде водных растворов, или в виде твердых порошков в тонкоизмельченной форме. Другие лекарственные формы, хотя они специально не перечислены, известны компетентным специалистам в данной области и входят в объем данного изобретения.

Лекарственные препараты для лечения эректильной дисфункции или вызывающие эрекцию у самцов животных, в том числе человека, могут содержать пептид, соответствующий данному изобретению, или его фармацевтически приемлемую соль или комбинации пептидов, соответствующих данному изобретению, или их фармацевтически приемлемых солей, необязательно в смеси с носителем, наполнителем, доставляющим средством, разбавителем, матриксом или покрытием для задержанного выхода. Примеры данных носителей, наполнителей, доставляющих средств и разбавителей можно найти в Справочнике по фармацевтическим наукам Ремингтона, 18 изд., под ред. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры представлены исключительно в качестве иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления данного изобретения и не предназначены для ограничения объема притязаний и сущности изобретения, что должно быть хорошо понятно компетентным специалистам в данной области.

Следующие примеры иллюстрируют активность четырех пептидов, которые являются репрезентативными в ряде предпочтительных вариантов осуществления изобретения:

(1) GAB-D-Mrp-D-Nal-Phe-Lys-NH₂,

(2) GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂,

(3) GAB-D-Mrp-D-Nal-Phe-Arg-NH₂ и

(4) GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂.

Перед получением препарата для соответствующего биологического теста синтезированные пептиды очищают до степени чистоты >95% с помощью колоночной хроматографии.

Методики исследования:

Метод, описанный в статье M.R. Melis и соавт., European Journal of Pharmacology, 328:115-123 (1997), существенно адаптирован следующим образом:

Животные:

Во всех экспериментах используют самцов крыс Sprague Dawley (массой 200-220 г) (Charles River, Como, Italy). Животных помещают в клетки группами по 4-6 особей при 24°С, влажности 60% освещении от 07.00 до 19.00 час без ограничений в воде и стандартном лабораторном корме. Эксперименты проводят между 09.00 и 13.00 час.

Фармацевтические соединения:

[d(СН₂)₅Tyr(Me)₂Orn⁸] вазотоцин и -контоксин-GVIA приобретают в фирме Peninsula Eur. Ltd. (St. Helen, Merseyside, UK), метиловый сложный эфир N^G-нитро-1-аргинина и дизолципин (МК-801) – в фирме Sigma (S. Louis, МО, USA), цис-флупентиксол-HCl – в фирме RBI (Natick, MA, USA) и морфин-HCl – в фирме SALARS (Como, Italy).

Микроинъекции в латеральные желудочки (i.c.v.) и в паравентрикулярное ядро гипоталамуса (PVN):

Направляющие канюли из нержавеющей стали (размер 22, 0,71 мм), предназначенные для унилатерального введения в PVN, стереотаксическим способом имплантируют (David Kopf Instruments, USA) при анестезии с помощью хлоралгидрата за два дня до начала экспериментов (координаты: 0,2 мм впереди брегмы, 0,4 мм сбоку относительно средней линии и 2,00 мм вентрально относительно твердой мозговой оболочки). Каждую крысу используют только один раз. Для i.c.v. и PVN инъекций используют канюли одного размера.

В случае i.c.v. инъекций все субстанции вводят в объеме 10 мкл физиологического раствора в течение 1 мин через внутреннюю канюлю (размер 28), которая выступает на 1 мм ниже конца направляющей канюли и соединена полиэтиленовой трубкой с Гамильтоновским шприцем объемом 10 мкл, который приводится в действие с помощью микрометрического винта. Контрольные животные получают 10 мкл физиологического раствора. После инъекции конец канюли оставляют в области инъекции в течение 30 сек, что обеспечивает распространение введенного раствора.

В случае PVN инъекций все субстанции вводят в объеме 0,3 мкл физиологического раствора в течение 2 мин через внутреннюю канюлю, которая выступает на 5,3 мм ниже конца направляющей канюли и соединена полиэтиленовой трубкой с Гамильтоновским шприцем объемом 10 мкл, который приводится в действие с помощью микроинфузионного насоса Stoelting. Контрольные животные получают 0,3 мкл физиологического раствора в PVN. После микроинъекции конец канюли оставляют в области инъекции в течение 30 сек, что обеспечивает распространение введенного раствора.

Исследования поведения:

После получения кривых зависимости от дозы каждый пептид или физиологический раствор вводят в виде микроинъекции в течение 2 мин в PVN крыс, которым имплантированы постоянные направляющие канюли. Физиологический раствор, -конотоксин, морфин, [d(СН₂)₅Tyr(Me)²Orn⁸] вазотоцин, L-NAME МК 801 или цис-флупентиксол инъецируют в течение 2 мин за 10 или 15 мин до физиологического раствора в PVN крыс, которым имплантированы постоянные направляющие канюли. L-NAME инъецируют i.c.v. в течение 1 мин за 10 или 15 мин до физиологического раствора или тест-пептида.

Вскоре после введения животных помещают по одному в плексигласовые клетки (30×30×30 см) и проводят наблюдение в течение 60 мин, в этот период времени наблюдатель, который не осведомлен о введениях, в целях устранения субъективных оценок, подсчитывает эпизоды эрекций полового члена.

Гистологические данные:

В конце экспериментов животных умерщвляют путем декапитации, головной мозг немедленно удаляют и сохраняют в 2% формальдегиде в течение 10-12 дней. Для локализации области инъекции поперечные срезы головного мозга толщиной 50 мкм, полученные с помощью замораживающего микротома, окрашивают нейтральным красным и исследуют в фазово-контрастном микроскопе. Область инъекции локализуют, следуя по ходу внутренней канюли в серии срезов головного мозга. В статистическую оценку результатов включают только тех животных, у которых обнаруживают правильно расположенный конец внутренней канюли при введении i.c.v. или в PVN.

Статистическая обработка:

Статистическую оценку результатов проводят путем одностороннего анализа вариаций (ANOVA) для повторяющихся измерений, с последующим многоранжевым тестом Duncan для сравнения различий между множеством групп, t-критерий Стьюдента используют для сравнения различий между двумя группами, р<0,025 считают значимым.

Пример 1

Эффект инъекции данных пептидов в PVN на спонтанные эрекции полового члена

Показано, что все четыре исследуемых пептида, введенных в PVN, способны повышать дозозависимым образом число эпизодов спонтанной эрекции полового члена у самцов крыс. Минимальная эффективная доза, которая повышает ответ у более чем 70% использованных животных, составляет 20-50 нг. Максимальный эффект, который индуцирует ответ у более чем 90% животных, обнаруживают при дозе 2-5 мкг. После введения активной дозы ответ начинается через 5-8 мин и продолжается в течение 50-60 мин. Каждый эпизод эрекции полового члена продолжается 0,5-2 мин и связан с чисткой гениталий, или она следует после эпизода. Вышеуказанные дозы также повышают число эпизодов спонтанной зевоты, хотя данный эффект не отмечают как связанный с эрекцией полового члена, и не обнаруживают ясной зависимости от дозы.

Пример 2

Эффект [d(СН₂)₅Tyr(Me)²Orn⁸]-вазотоцина на индуцированную данными пептидами эрекцию полового члена

[d(СН₂)₅Tyr(Me)²Orn⁸]-вазотоцина, антагонист рецептора окситоцина (в дозе 0,1, 0,5 и 1 мкг), введенный i.c.v. за 10 мин до данных пептидов, снижает дозозависимым образом увеличение числа эпизодов эрекции полового члена, индуцированных введением 2 мкг данных пептидов в PNV. Напротив, антагонист рецептора окситоцина (в дозе 0,1, 0,5 и 1 мкг) неэффективен при введении в PVN за 10 мин до данных пептидов.

Пример 3

Эффект L-NAME на индуцированную данными пептидами эрекцию полового члена

L-NAME, ингибитор NO-синтазы (в дозе 10-20 мкг), инъецированный в PVN за 10 мин до данных пептидов, снижает дозозависимым образом эрекции полового члена, индуцированные введением 2 мкг тест-пептидов в PNV. Аналогичное предупреждение эффекта наблюдают при i.c.v. введении L-NAME в дозах 75 и 150 мкг за 10 мин до инъекции 2 мкг тест-пептидов в PVN.

Пример 4

Эффект -конотоксина-GVIA на индуцированную тест-пептидом эрекцию полового члена

Блокатор канала Са²⁺ N-типа -конотоксин-GVIA (в дозе 2 и 5 мкг), инъецированный в PVN за 10 мин до инъекции 2 мкг тест-пептидов в PVN, снижает эрекцию полового члена.

Пример 5

Эффект морфина на индуцированную тест-пептидами эрекцию полового члена

Опиат морфин (в дозе 1,5 и 10 мкг), инъецированный в PVN за 15 мин до тест-пептидов, снижает дозозависимым образом эрекции полового члена, индуцированные введением тест-пептидов в дозе 2 мкг в PNV.

Пример 6

Эффект МК-801 или цис-флупентиксола на индуцированную тест-пептидами эрекцию полового члена

Антагонист рецептора NMDA-возбуждающих аминокислот МК-801 (в дозе 1 мкг) или антагонист допаминового рецептора цис-флупентиксол (в дозе 10 мкг), введенные в PVN за 15 мин до тест-пептидов, не модифицируют эрекцию полового члена.

Пример 7

Системное введение

Эрекцию полового члена наблюдают у всех животных, которым данные пептиды инъецируют (в дозе 50 мкг/50 мкл) подкожно или в яремную вену.

Формула изобретения

1. Способ вызывания эрекции полового члена у самца животного, отличающийся тем, что указанному животному вводят пептид, имеющий формулу

X-A-B-C-Y-NH₂,

в которой Х – -аминоизобутирил, транексамил (т.е. 4-(аминометил)цикло-гексанкарбонил), изонипекотинил, -аминобутирил, водород или имидазолилацетил,

А – D-2-метилтриптофан, D--(2-нафтил)аланин или D-триптофан,

В – D-2-метилтриптофан, D--(2-нафтил)аланин, D-триптофан или отсутствует,

С – D-2-метилтриптофан, фенилаланин или отсутствует,

Y – лизин или аргинин,

где D означает декстроизомер,

или фармацевтически приемлемую соль пептида в количестве, эффективном для того, чтобы вызывать указанную эрекцию.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептид вводят интраназально, внутрилегочно или внутриглазно.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептид вводят защечно, подъязычно или перорально.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве пептида используют

GAB-D-Mrp-D-Na1-Phe-Lys-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Na1-Phe-Arg-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂

или их фармацевтически приемлемые соли.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептид вводят в дозе, находящейся между 0,2 и 2 мг/кг массы тела животного.

6. Способ лечения эректильной дисфункции у самца животного, отличающийся тем, что указанному животному вводят пептид, имеющий формулу

X-A-B-C-Y-NH₂,

в которой Х – -аминоизобутирил, транексамил (т.е. 4-(аминометил)цикло-гексанкарбонил), изонипекотинил, -аминобутирил, водород или имидазолилацетил,

А – D-2-метилтриптофан, D--(2-нафтил)аланин или D-триптофан,

В – D-2-метилтриптофан, D--(2-нафтил)аланин, D-триптофан или отсутствует,

С – D-2-метилтриптофан, фенилаланин или отсутствует,

Y – лизин или аргинин,

где D означает декстроизомер,

или фармацевтически приемлемую соль пептида в количестве, эффективном для того, чтобы вызывать эрекцию.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что пептид вводят интраназально, внутрилегочно или внутриглазно.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что пептид вводят защечно, подъязычно или перорально.

9. Способ по п.6, отличающийся тем, что в качестве пептида используют

GAB-D-Mrp-D-Na1-Phe-Lys-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Na1-Phe-Arg-NH₂;

GAB-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH₂

или их фармацевтически приемлемые соли.

10. Способ по п.6, отличающийся тем, что пептид вводят в дозе, находящейся между 0,2 и 2 мг/кг массы тела животного.

11. Пептид, имеющий формулу

X-A-B-C-Y-NH₂,

в которой Х – -аминобутирил,

А – D-2-метилтриптофан,

В – С – Y означает В--(2-нафтил)аланин – фенилаланин – аргинин или D-2-метилтриптофан – лизин, при этом С отсутствует, где D означает декстроизомер,

или его фармацевтически приемлемые соли.

12. Фармацевтическая композиция, обладающая стимулирующей активностью в отношении эректильной функции и содержащая эффективное количество пептида или его фармацевтически приемлемой соли, охарактеризованных в п.11, и фармацевтически приемлемый носитель.

TK4A – Поправки к публикациям сведений об изобретениях в бюллетенях “Изобретения (заявки и патенты)” и “Изобретения. Полезные модели”

Страница: 49-50

Напечатано: (57) 4. и 9. …GAB-D-Mrp-D-Na1-Phe-…

Следует читать: (57) 4. и 9. …GAB-D-Mrp-D-Nal-Phe-…

Номер и год публикации бюллетеня: 33-2005

Код раздела: FG4A

Извещение опубликовано: 27.03.2006 БИ: 09/2006

TK4A – Поправки к публикациям сведений об изобретениях в бюллетенях “Изобретения (заявки и патенты)” и “Изобретения. Полезные модели”

Страница: 49-50

Напечатано: 11. …B-C-Y означает B--(2-нафтил)…

Следует читать: 11. …B-C-Y означает D--(2-нафтил)…

Номер и год публикации бюллетеня: 33-2005

Код раздела: FG4A

Извещение опубликовано: 27.03.2006 БИ: 09/2006

TZ4A – Поправки к описаниям изобретений

Часть описания, где обнаружена ошибка: Текст опис., страница 4, строка 41

Напечатано: […(Me)₂ Orn⁸]… и -контоксин-…

Следует читать: […(Me)² Orn⁸]… и -конотоксин-…

Номер и год публикации бюллетеня: 33-2005

Извещение опубликовано: 27.03.2006 БИ: 09/2006

TZ4A – Поправки к описаниям изобретений

Часть описания, где обнаружена ошибка: страница 6, строка 3

Напечатано: [ … ] – вазотоцина,…

Следует читать: [ … ] – вазотоцин,…

Номер и год публикации бюллетеня: 33-2005

Извещение опубликовано: 27.03.2006 БИ: 09/2006

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 05.11.2006

Извещение опубликовано: 20.12.2007 БИ: 35/2007