Патент на изобретение №2264101
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА И ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS
(57) Реферат:
Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству средств защиты растений от вредных насекомых. Предложен способ получения инсектицидного препарата и препарат на основе бактерий Bacillus thuringiensis. Способ включает культивирование бактерий Bacillus thuringiensis, выделение из биомассы дельта-эндотоксина путем введения растворителя, удаление осадка и смешивание раствора с наполнителем и прилипателем с дальнейшим высушиванием целевого продукта. Инсектицидный препарат, полученный предложенным способом, имеет следующий состав, мас.%: действующее начало – растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis – 10-20%, щелочь (NaOH или КОН) – 3-8%, восстановитель –
Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству средств защиты растений от вредных насекомых. Многие пестицидные препараты на основе бактерий рода Bacillus в качестве действующего начала содержат споры и бактерии, наличие которых при обработке против вредителей обеспечивает длительное действие и защиту (SU 1713145, SU 1792281, RU 2128915). Однако экологическая безопасность и целесообразность применения инсектицидов, содержащих бактерии и споры микроорганизмов, вызывает сомнение. Согласно современным экологическим представлениям излишнее обсеменение спорами бактерий окружающей среды является нежелательным, поскольку может нарушить естественный баланс почвенной, наземной и водной флоры и фауны. В случае Вас.thuringiensis установлено и общепринято, что споры практически не вносят вклада в возникновение патологии у насекомых. В связи с этим наличие спор в препаратах можно считать не только излишним, но и нежелательным (Квятковская И.Я., Слинько В.Н., Калинина Л.Н. Деп.ВИНИТИ, М., 1989, 15 с.). Известны способы получения энтомопатогенных препаратов, содержащих в качестве действующего начала токсин в чистом виде, то есть без бактерий и спор (SU 204831, SU 1792613). Однако данные способы не позволяют полностью выделить целевой продукт из биомассы с получением препарата достаточной активности по отношению к вредителям. В авторском свидетельстве SU 204831 выделяют весь спектр токсинов без выделения необходимой фракции, т.е. полученный препарат не обладает необходимой избирательностью. В SU 1792613 получают препарат, очищенный от сопутствующих высокомолекулярных веществ на основе небелкового Предлагаемый способ предусматривает удаление Наиболее близким к предлагаемому способу и препарату является способ получения инсектицидного (энтомопатогенного) препарата и препарат, описанный в патенте RU 2062577. Способ предусматривает культивирование бактерий Bacillus thuringiensis, выделение из биомассы дельта-эндотоксина, растворение кристаллов в щелочи, удаление осадка и смешивание с наполнителем. Способ позволяет путем добавления в активную фракцию биомассы щелочи растворить действующее начало целевого продукта, а именно кристаллы дельта-эндотоксина. Отделение осадка позволяет получить практически чистый раствор дельта-эндотоксина, что повышает активность целевого продукта и, как следствие, снижает его расход. Использование в качестве прилипателя спиртовой барды, являющейся биологически и химически инертным веществом одновременно в качестве наполнителя и прилипателя, упрощает технологию приготовления и повышает экономичность производства инсектицидного препарата. Однако данный способ не позволяет растворить дельта-эндотоксин, являющийся только протоксином, полностью. Наличие частично растворенного в результате щелочного гидролиза кристаллического белка снижает активность препарата, увеличивает время его действия и ограничивает круг насекомых-объектов борьбы. Предлагаемый усовершенствованный способ включает культивирование бактерий Bacillus thuringiensis, выделение из биомассы дельта-эндотоксина путем введения растворителя, удаление осадка и смешивание раствора с наполнителем и прилипателем с дальнейшим высушиванием целевого продукта. Способ отличается от известного тем, что перед выделением дельта-эндотоксина из биомассы биомассу подвергают центрифугированию или сепарации для удаления растворимых компонентов среды и микробных метаболитов ( Объектом данного изобретения является также инсектицидный препарат, полученный предложенным способом. Препарат имеет следующий состав, мас.%:
Опытным путем установлено то, что предлагаемые технологические приемы позволяют значительно снизить время растворения. Так, по экспериментальным данным в способе согласно RU 2062577 время растворения составляет 6-8 ч, тогда как в новом способе в присутствии восстановителя время сокращается до 2-3 ч. При этом более длительные сроки нецелесообразны, т.к. токсин в основном переходит в растворимое состояние за 2-3 часа, а продление времени ухудшает технологические характеристики процесса (его продолжительность). При использовании предложенного способа выход препарата увеличился в 1,5-2 раза. В табл.1 приведены сравнительные данные по количеству токсина, получаемого известным и предлагаемым способом.
Предлагаемый способ позволяет сократить время растворения. Например, при растворении в щелочи в течение часа в раствор переходит около 90 мг токсина из 1 г сухой бактериальной биомассы, а в случае щелочь + восстановитель – около 160 мг/г. Таким образом, улучшаются технологические параметры процесса (время), т.к. растворение прошло в течение 0,5 часа. Кроме того, повышается активность продукта, а именно скорость наступления конечного эффекта при применении, так как продукт не требует активации в кишечнике насекомого. В табл.2 приведены сравнительные данные о скорости воздействия инсектицидных препаратов на непарного шелкопряда III возраста.
Важным результатом снижения времени действия, кроме увеличения % погибших насекомых, является снижение поврежденности растений. Технический результат предложенной группы изобретений состоит в том, что предлагаемый способ по сравнению с прототипом позволяет снизить время растворения дельта-эндотоксина в 2 раза и более и получить препарат, обладающий большей инсектицидной активностью при одном и том же времени растворения в кишечнике насекомого. При этом содержащийся в препарате дельта-эндотоксин соответствует по активности токсину, приобретшему токсичность в кишечнике насекомого, т.е. он может сразу же действовать на чувствительные клетки кишечника, разрушая их. Это сокращает время начала действия и усиливает общий эффект (смертность насекомых). Изобретение также позволяет повысить избирательность и эффективность препаратов на основе Bacillus thuringiensis, увеличить выход целевого продукта путем более полного растворения кристаллов дельта-эндотоксина и расширить арсенал средств, используемых для борьбы с вредными насекомыми. Инсектицидный препарат может быть получен предлагаемым способом практически из любого штамма вида Bacillus thuringiensis, поскольку известно, что все подвиды данного вида микроорганизма продуцируют дельта-эндотоксин. Изобретение реализуется следующим образом. Пример 1. Глубинное культивирование штамма Вас.thurigiensis subsp. Kurstaki 532 осуществляли в рабочих ферментерах при 28-30°С. Затем выделили активную фракцию сепарацией биомассы. Полученная после сепарации пастообразная активная фракция содержит элементы культуральной среды, бактериальные клетки, споры, действующее начало кристаллы дельта-эндотоксина и другие продукты метаболизма. Указанную активную фракцию (осадок) растворяли в водном растворе Получили препарат следующего состава: содержание действующего начала – растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis – 10%,NaOH – 3%, Пример 2. Способ реализуется согласно примеру 1. В качестве растворителя использовали водный раствор Получили препарат следующего состава: содержание действующего начала – растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis – 20%, КОН – 6%, Пример 3. Способ реализуется согласно примеру 1. В качестве растворителя использовали водный раствор Получили препарат следующего состава: содержание действующего начала – растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis – 15%, NaOH – 5%, Пример 4. Способ реализуется согласно примеру 1. В качестве растворителя использовали водный раствор Получили препарат следующего состава: содержание действующего начала – растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis – 15%, КОН – 6%, Пример 5. Способ реализуется согласно примеру 1. В качестве растворителя использовали водный раствор Получили препарат следующего состава: содержание действующего начала – растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis – 10%, КОН – 6%, Пример 6. Способ реализуется согласно примеру 1. В качестве растворителя использовали водный раствор Получили препарат следующего состава: содержание действующего начала – растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis – 20%, КОН – 8%, Приведенные в табл.3 данные показывают, что адгезивная способность и стабильность рабочей суспензии бактериального препарата, полученного предлагаемым способом, не уступает таковым у препарата, полученного известным способом. Обусловлено это тем, что в качестве наполнителя и прилипателя также использованы биологически и химически инертные компоненты, повышающие адгезивную способность препарата. Кроме того, высокие физические свойства препарата обусловлены еще и тем, что частицы полученного целевого продукта меньшего размера, чем частицы известного продукта, поскольку способ позволяет достичь более полного растворения кристаллов. Следовательно, предлагаемый способ позволяет расширить возможность использования в качестве стабилизаторов и прилипателей при получении инсектицидных препаратов отходов пищевых и микробиологических производств В лабораторных условиях определяли инсектицидную активность бактериального инсектицидного препарата, полученного заявляемым способом, по сравнению с препаратом, полученным известным способом, на гусеницах капустной белянки. Опыты проводили в пяти повторностях. Гусениц заражали перорально и высаживали в садки на корм по 15 особей в каждый. Достоверность полученных результатов оценивали методом дисперсионного анализа. Результаты представлены в табл.4. Полученный предлагаемым способом препарат обладает значительно большей инсектицидной активностью, чем препарат, полученный известным способом. Концентрации предлагаемого препарата в рабочей суспензии, обеспечивающие 100% гибель гусениц, в 2 раза меньше, чем концентрация известного препарата. Это позволяет значительно снизить нормы расхода препарата и повысить экономическую эффективность при применении инсектицидных средств. Анализ данных табл.4 также показывает, что в препарат нецелесообразно вводить больше 20% действующего начала, т.к. 100% гибель гусениц достигается и при такой концентрации. Увеличение концентрации также приведет к удорожанию препарата. При концентрации препарата в рабочей суспензии менее 10% значительно снижается его эффективность. Инсектицидную активность препарата, полученного заявляемым способом, сравнивали с инсектицидной активностью препарата, полученного известным способом, определяя концентрацию, вызывающую гибель на третьи сутки 50% насекомых (гусениц капустной белянки, участвующих в опыте (ЛК50). Результаты приведены в таблице 5. Как следует из данных, приведенных в табл.5, препараты, полученные предлагаемым способом, более эффективны по сравнению с препаратом, полученным известным способом. Летом 2001 препарат был испытан для защиты леса от чешуекрылых листогрызущих вредителей (шелкопряд монашенка) против гусениц 1-2 возраста на сосне с примесью лиственных пород. Площадь испытаний составила 15 га. Использовали препараты, полученные по примерам 1-3. Для обработок использовали аэрозольный генератор ГАРД-М-20. Норма расхода препаратов по примерам составляла 0,01 кг/га при расходе рабочей жидкости 0,2 л/га. Действие препарата сравнивали с действием бактериального лепидоцида (норма расхода 1 кг/га) и химического Децис (0,05-0,06 кг/га). Препарат, полученный по примеру 2, показал при учетах на 5-е сутки эффективность 92%, лепидоцид – 80% и Децис – 92%. Испытания подтвердили высокую инсектицидную активность препарата, сравнимую с действием химических инсектицидов. В ходе испытаний были также получены данные о безопасности препарата для полезной энтомофауны (перепончатокрылых насекомых опылителей и энтомофагов). В результате обработки не пострадал ни один из установленных видов, тогда как в результате действия химического препарата Децис исчезло 10 видов из 17. Экономическая оценка показала, что применение предлагаемого препарата аэрозольным способом оказалось в 4-7 раз дешевле, чем лепидоцида тем же способом и в 1400 раз дешевле, чем авиационным способом. Известно, что недостаточно эффективные дозы препаратов, а также продолжительность их действия приводят к тому, что часть пораженных насекомых выживает, что приводит к накоплению мутаций в популяциях насекомых. При этом эффективность от последующих применений подобных препаратов снижается и способствует повышению адаптационных способностей у насекомых. Предлагаемое изобретение позволяет получить высокоэффективный быстродействующий инсектицидный препарат, а также повысить избирательность и эффективность препаратов на основе Bacillus thuringiensis, увеличить выход целевого продукта путем полного растворения кристаллов дельта-эндотоксина и расширить арсенал средств, используемых для борьбы с вредными насекомыми.
Формула изобретения
1. Способ получения инсектицидного препарата, включающий культивирование бактерий Bacillus thuringiensis, выделение из биомассы дельта-эндотоксина путем введения растворителя, удаление осадка и смешивание раствора с наполнителем и прилипателем с дальнейшим высушиванием целевого продукта, отличающийся тем, что перед выделением из биомассы дельта-эндотоксина из нее выделяют активную фракцию – осадок, который растворяют в водном растворе восстановителя в щелочи, при этом в качестве восстановителя используют 2. Инсектицидный препарат на основе бактерий Bacillus thuringiensis, содержащий в качестве действующего начала растворенный дельта-эндотоксин, а в составе целевых добавок растворитель, прилипатель-стабилизатор, наполнитель, отличающийся тем, что получен согласно способу по п.1 и имеет следующий состав, мас.%:
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
-меркаптоэтанол – 1-8%, прилипатель – стабилизатор рабочей суспензии – меласса, или сухая пахта, или пектин, или сыворотка, или гидролизованный хитин, или рыбий клей размолотый, или пектин из свекловичного или яблочного жома – 3-20%, наполнитель, например NaCl – до 100%. Способ позволяет получить высокоэффективный быстродействующий инсектицидный препарат. 2 н.п. ф-лы, 5 табл.
-эндотоксин (дельта-эндотоксин) белковой природы. В результате достигается высокая экологическая безопасность при очень высокой биологической эффективности (препарат в 10-30 раз более эффективен по сравнению со споросодержащими).
, 
-экэотоксины), не обладающих избирательной токсичностью. Затем в полученный осадок, содержащий кристаллы, споры и вегетативные клетки, вносят водный раствор смеси щелочи (0,16% гидроксида натрия или калия) и 0,04-0,08%