Патент на изобретение №2263917

(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПАТОЛОГИИ МОЛЕКУЛЫ АЛЬФА-2-МАКРОГЛОБУЛИНА У БОЛЬНЫХ С ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМОЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к нейрохирургии и невропатологии, нейрохимии, физиологии. Сущность способа выявления патологии молекулы альфа-2-макроглобулина у больных с черепно-мозговой травмой: одновременно проводят количественное определение альфа-2-макроглобулина в спинномозговой жидкости больного путем электрофоретического исследования и исследование ингибиторной ферментативной активности альфа-2-макроглобулина с низкомолекулярным синтетическим субстратом N-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилидом (БАПНА). При определении наличия белка электрофоретическим методом, но отсутствии у него ингибиторной ферментативной активности выявляют патологию молекулы альфа-2-макроглобулина у больного с черепно-мозговой травмой. Использование способа позволяет повысить точность выявления патологии молекулы альфа-2-макроглобулина, что способствует своевременному назначению адекватной терапии у больных с черепно-мозговой травмой.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”ВЕРЕМЕЕНКО К.Н. и др.
SU 1359253 А1 15.12.1987.
SU 977490 А1 30.11.1982.

Изобретение относится к области медицины, а именно к нейрохирургии и невропатологии, нейрохимии, физиологии и может быть использовано для оценки патологии белковых молекул с ингибиторной ферментативной активностью в биологических жидкостях, в частности в спинномозговой жидкости (СМЖ).

Одним из самых крупных белков организма, обладающих ингибиторной ферментативной активностью, является высокомолекулярный ингибитор протеолитических ферментов всех четырех известных классов протеиназ – альфа-2-макроглобулин (₂-МГ). Для него характерен особый механизм взаимодействия с протеолитическими ферментами и поэтому его относят к важнейшим регуляторам их активности. Белковые молекулы ₂-МГ существуют в виде макромолекулярных комплексов, которые взаимодействуют с рецепторным аппаратом клеточной поверхности, что приводит к изменению функциональной активности клеток. Все вышесказанное заставляет думать о целесообразности исследования этого белка в биологических жидкостях человека, в том числе и СМЖ, и предполагать его безусловную значимость при различных патологиях.

Известен способ оценки патологии белковых молекул с ингибиторной ферментативной активностью, включающий радиальную иммунодиффузию в геле по Манчини (Manchini, G.,Carbonara, A.O. and Heremans, J.F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Int. J.Immunochem. 2 235-254 (1965) с использованием специфических антител. Недостатком этого способа является то, что он оценивает лишь количественный параметр молекул ₂-МГ и свидетельствует в большей степени о структуре белковой молекулы, а не о ее биологической активности.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ оценки патологии белковых молекул, обладающих ингибиторной ферментативной активностью, путем проведения диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) (Ornstein L(1964)Disc-electrophoresis I. Background and theory. Ann. №4. Acad. Sci. l21,321), принятый за прототип. Способ заключается во фракционировании белковых смесей в зависимости от электрического заряда и молекулярной массы входящих в состав белковых молекул. Способ позволяет увидеть общие изменения фракций белкового спектра, в том числе и изменение ингибитора протеиназ ₂-МГ. При оценке результатов, полученных данным способом, оценивают количественные различия фракций белкового спектра исследуемой биологической жидкости по сравнению с нормой. Однако прототип недостаточно точен, так как оценивает лишь количественный параметр белковых молекул по электрофоретической подвижности и молекулярной массе, но не позволяет оценить их биологическую активность.

Изобретение направлено на создание способа оценки патологии белковых молекул с ингибиторной ферментативной активностью, обеспечивающего повышение точности способа за счет дополнительного исследования ингибиторной ферментативной активности белковых молекул.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе оценки патологии белковых молекул с ингибиторной ферментативной активностью, включающем электрофоретическое исследование белка, особенность заключается в том, что одновременно проводят исследование ингибиторной ферментативной активности белковых молекул с различными низкомолекулярными синтетическими субстратами и при выявлении наличия белка, но при отсутствии у него ингибиторной ферментативной активности, констатируют наличие патологии в белковой молекуле.

Благодаря одновременному исследованию белковых молекул электрофоретически и определению их ингибиторной ферментативной активности с помощью синтетических низкомолекулярных субстратов оценивают биологическую активность ₂-МГ (ее наличие или отсутствие), что свидетельствует о патологии в белковых молекулах.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Проводят исследование белковых молекул ₂-МГ в образце биологической жидкости, например СМЖ, полученном при люмбальной пункции, определяют в нем общее содержание белка любым количественным методом, число клеточных элементов крови, осаждают их центрифугированием при 1500-2000 об/мин в течение 20 минут. В полученном супернатанте определяют ингибиторную ферментативную активность комплекса белковых молекул ингибитора ₂-МГ с трипсином по отношению к синтетическому низкомолекулярному субстрату N-бензоил -DL-аргинин-п-нитроанилиду (БАПНА) по модифицированному методу (Веремеенко К.Н., Васильева Т.Г., Доброгорская Л.Н., Краева Л.Н., Гончарова В.П. ₂-Макроглобулин в спинномозговой жидкости при нейрохирургических заболеваниях. Вопросы медицинской химии, 1989, №6, с.48-51): к 0,8 мл СМЖ _{прибавляют} 0,05 мл раствора трипсина, содержащего 60 мкг фермента и 0,05 раствора ингибитора из бобов сои, содержащего 100 мкг последнего, для нейтрализации свободного трипсина. Доводят смесь фосфатным буфером до 1 мл, термостатируют в водяной бане при температуре 30°С, прибавляют 3,2 мл раствора субстрата БАПНА, вследствие чего образуется пара-нитроанилин, оптическую плотность которого измеряют спектрофотометрически при длине волны 383 нм. Количество образовавшегося пара-нитроанилина служит мерой активности молекулы ₂-МГ или ее отсутствия. Одновременно проводят исследование этого же образца СМЖ методом модифицированного классического диск-электрофореза в ПААГ (Алексеева Л.А., Вальберг А.Ю. Качественное и количественное распределение белков спинно-мозговой жидкости человека по данным диск-электрофореза в полиакриламидном геле. Лабораторное дело, 1985, №4, с. 204-207). Электрофорез проводят в 6,2% ПААГ в трис-глициновом буфере при рН 8,3, при силе тока 50 мА и напряжении 400 В на любом из приборов вертикального электрофореза в стеклянных трубочках. В каждую трубочку вносят 0,1 мл образца СМЖ (концентрация образца в образце не должна превышать 100 мкг). После окончания электрофореза гели окрашивают специфическим красителем на белок. Окрашенные столбики геля денситометрируют при длине волны 620 нм. Высота каждого белкового пика на протеинограмме прямо пропорциональна его количественному содержанию. При определении количественного содержания белковых молекул ₂-МГ в исследуемом образце биологической жидкости отсутствие ингибиторной ферментативной активности свидетельствует о патологии белковых молекул ₂-МГ.

Заявляемый способ разработан в РНХИ им. проф. А.Л.Поленова и прошел клинические испытания при исследовании 42 образцов СМЖ. При этом в 11,9% случаев обнаружена патология белковых молекул с ингибиторной ферментативной активностью.

Приводим примеры-выписки из журнала регистрации биохимических исследований №4.

Пример 1.

Наблюдение №31. Больной А 46 лет. Диагноз: закрытая черепно-мозговая травма, ушиб головного мозга тяжелой степени, очаги размозжения теменно-височной области справа, субдуральная гематома, субарахноидальное кровоизлияние.

Для исследования было взято 2,8 мл СМЖ, полученной при люмбальной пункции в первые сутки после травмы. Для определения общего белка и цитоза в полученном образце СМЖ было взято 1,6 мл. Общий белок составил 1,15 г/л, цитоз – 6×10⁶ кл/л (нейтрофилы – 1×10⁶ кл/л, лимфоциты – 5×10⁶ кл/л), эритроциты – 11930×10⁶ /л. 1,2 мл СМЖ было отцентрифугировано при 2000 об/мин в течение 15 минут для осаждения клеточных элементов крови и полученный супернатант взят для дальнейшего биохимического исследования. 0,1 мл СМЖ было взято для электрофоретического исследования ₂-МГ. 1 мл был взят для определения трипсинсвязывающей активности ₂-МГ с использованием низкомолекулярного синтетического субстрата БАПНА.

В результате проведенного исследования обнаружено, что абсолютное содержание ₂-МГ составило 0,093 г/л (повышено по сравнению с нормальным значением), а трипсинсвязывающая активность – 0,087 г/л (повышено по сравнению с нормальным значением). Таким образом, в данном наблюдении у больного А патология белковых молекул не выявлена. На 37 день после травмы больной переведен в больницу г.Сестрорецка, в отделение реабилитации для дальнейшего лечения.

Пример 2.

Наблюдение №98. Больной Б 32 лет. Диагноз: закрытая черепно-мозговая травма, ушиб головного мозга тяжелой степени, очаги размозжения лобно-теменно-височной области справа, внутримозговая гематома правого полушария, субарахноидальное кровоизлияние.

Для исследования было взято 3,0 мл СМЖ, полученной при люмбальной пункции в первые сутки после травмы. Для определения общего белка и цитоза в полученном образце СМЖ было взято 1,8 мл. Общий белок составил 1,25 г/л, цитоз 42×10⁶ кл/л (нейтрофилы – 8×10⁶ кл/л, лимфоциты – 33×10⁶ кл/л, макрофаги – 1×10⁶ кл/л), эритроциты – 93900×10⁶ /л. 1,2 мл СМЖ центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 минут для осаждения клеточных элементов крови и полученный супернатант взят для дальнейшего биохимического исследования. 0,1 мл СМЖ было использовано для электрофоретического исследования ₂-МГ, 1 мл – для определения его трипсинсвязывающей активности с использованием синтетического низкомолекулярного субстрата БАПНА.

В результате проведенного исследования обнаружено, что абсолютное содержание ₂-МГ составило 0,098 г/л (повышено по сравнению с нормальным значением). Определение же трипсинсвязывающей активности этого белка не выявило наличия ингибиторной (биологической) активности. Таким образом, у больного Б наблюдалось явление патологии белковых молекул ₂-МГ, характеризующееся наличием синтезируемых молекул, но с отсутствующей у них ингибиторной ферментативной активностью. Летальный исход у данного больного наступил на 7 сутки после травмы.

Использование заявляемого способа позволяет повысить точность выявления патологии молекулы альфа-2-макроглобулина. У больных с черепно-мозговой травмой выявление патологии молекулы альфа-2-макроглобулина свидетельствует о тяжелом состоянии больного и высокой вероятности неблагоприятного исхода. Подобное состояние организма требует не только применения ингибиторов с целью компенсации недостающей ингибиторной емкости альфа-2-макроглобулина, но и проведения дополнительных детоксикационных мероприятий, таких как гемосорбция и ликворосорбция. Выявление патологии молекулы альфа-2-макроглобулина у больных с черепно-мозговой травмой позволяет своевременно назначить адекватную терапию.

Формула изобретения

Способ выявления патологии молекулы альфа-2-макроглобулина у больных с черепно-мозговой травмой, включающий электрофоретическое исследование спинно-мозговой жидкости больного, отличающийся тем, что дополнительно проводят исследование ингибиторной ферментативной активности альфа-2-макроглобулина с низкомолекулярным синтетическим субстратом N-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилидом (БАПНА) и, при определении наличия белка электрофоретическим методом, но отсутствии у него ингибиторной ферментативной активности, выявляют патологию молекулы альфа-2-макроглобулина у больного с черепно-мозговой травмой.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 19.10.2006

Извещение опубликовано: 20.02.2008 БИ: 05/2008