Патент на изобретение №2263149
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СРЕДСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ L-ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА К РИФАМПИЦИНУ
(57) Реферат:
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может найти применение в медицине. В изобретении описывается применение биологического микрочипа «ТБ-Биочип (РИФ)» для определения лекарственной чувствительности к рифампицину L-форм микобактерий туберкулеза. Предварительно подтверждают таксономическую принадлежность L-форм к микобактериям туберкулеза и выделяют ДНК из L-форм микобактерий туберкулеза, которую затем исследуют с использованием микрочипа «ТБ-Биочип (РИФ)». Лекарственную чувствительность к рифампицину определяют по наличию мутации в rpoB-гене. Использование «ТБ-Биочипа (РИФ)» для определения лекарственной чувствительности к рифампицину L-форм микобактерий туберкулеза обеспечивает коррекцию лекарственного лечения больных туберкулезом, у которых своевременно выявлена лекарственная устойчивость L-форм микобактерий туберкулеза к рифампицину. 2 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и предлагает средство для диагностики лекарственной чувствительности L-форм Mycobacterium tuberculosis к рифампицину. Использование указанного средства основано на применении биологического микрочипа «ТБ-Биочип (РИФ)» для обнаружения в rpoB-гене ДНК L-форм микобактерий мутаций, обусловливающих резистентность к рифампицину. Туберкулез является одной из самых актуальных проблем современной медицины во всем мире. Сложившаяся в Российской Федерации эпидемическая ситуация с туберкулезом оценивается в последние годы как весьма неблагоприятная. С другой стороны, одной из причин, способствующих подъему заболеваемости туберкулезом, является широкое распространение лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий, устойчивых к одному из наиболее эффективных противотуберкулезных препаратов – рифампицину. В то же время известно, что резистентность к рифампицину в 95% случаев является маркером лекарственной устойчивости к изониазиду, что опосредованно свидетельствует о наличии множественной лекарственной устойчивости. До настоящего времени не существует способа определения лекарственной чувствительности L-форм. Классические методы определения лекарственной чувствительности бактериальных форм МБТ не могут быть использованы в отношении L-форм, так как последние культивируются с большим трудом и в процессе субкультивирования на питательных средах часто утрачивают жизнеспособность. Определение их лекарственной чувствительности возможно только в случае получения реверсии в бактериальную форму, что далеко не всегда достижимо и требует от 4 до 9 месяцев пассирования на питательных средах. Развитие и совершенствование молекулярно-биологических методов открыло новые перспективы диагностики лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза, основанные на анализе последовательностей ДНК Mycobacterium, поскольку для ряда препаратов известны фрагменты генов, мутации в которых приводят к возникновению резистентности. Определение типа мутации L-форм, выделяемых из организма больного, может оказаться ключевым моментом в выборе схемы лечения. На основании анализа мутаций, приводящих к устойчивости к рифампицину, а затем и к другим препаратам, можно до начала лечения определить, имеет ли смысл назначать данному больному рифампицин, или необходимо использовать резервные препараты второго ряда, или же своевременно решать вопрос о хирургическом вмешательстве и степени эпидемиологической опасности очага. Принципиально новым подходом к выявлению мутаций, в том числе ответственных за возникновение лекарственной устойчивости у патогенных микроорганизмов, являются биологические микрочипы – уникальное средство биомедицинской диагностики. Микрочипы успешно применяют для оценки генетического полиморфизма ДНК. Способность зондов гибридизоваться с тестируемой ДНК сильно изменяется при наличии даже единичных мисматчей. Это позволяет с высокой эффективностью осуществлять поиск и выявление полиморфизма генома даже на уровне различий в отдельных нуклеотидах (Патрушев Л.И. Экспрессия генов. – М.: Наука, – 2000, – с.462-463). В настоящее время в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН создан биологический микрочип («ТБ-Биочип (РИФ)»), способный детектировать 28 вариантов мутаций гена rpoB, обусловливающих устойчивость микобактерий к рифампицину. Этот метод позволяет получить сведения о наличии лекарственной устойчивости к рифампицину в максимально короткие (двое суток) сроки, тогда как классические микробиологические методы требуют для этого 3-4 месяцев. Изложенное определяет актуальность предлагаемого изобретения как средства для ускоренного определения лекарственной устойчивости L-форм МБТ к рифампицину с помощью вышеназванного микрочипа. Таким образом, известен молекулярно-биологический метод определения резистентности МБТ к рифампицину с помощью биологических микрочипов. Метода определения лекарственной чувствительности L-форм до настоящего времени не существует. Методика применения предлагаемого средства для определения лекарственной чувствительности L -форм МБТ включает следующие этапы: 2. Определение чувствительности к рифампицину с помощью биологического микрочипа «ТБ-Биочип (РИФ)»: – выделение ДНК, полученных при культивировании L-форм МБТ с последующей ее амплификацией в процессе проведения двухстадийной мультиплексной ПЦР. Электрофорез полученных продуктов ПЦР в 3% агарозном геле, пропитанном этидиум бромидом; – гибридизация полученных продуктов амплификации с дискриминирующими олигонуклеотидными зондами, находящимися на биологическом микрочипе. Регистрация и анализ результатов гибридизации производятся с помощью сверхчувствительной ПЗС-камеры по специальной компьютерной программе; – наличие мутаций в исследуемой области rpoB-гена определяется по силе свечения меченного олигонуклеотида. Обнаружение их в исследуемом кодоне, с которым произошла гибридизация, свидетельствует о резистентности данного штамма к рифампицину. Контроль результатов определения лекарственной чувствительности L-форм осуществлялся двумя методами: – методом абсолютных концентраций для бактериальных штаммов МБТ, выделенных из того же материала, что и L-формы, и – молекулярно-биологическим методом с помощью микрочипа «ТБ-Биочип (РИФ)» для образцов ДНК L-форм МБТ, а также ДНК бактериальных форм МБТ, полученных из биологических образцов и выделенных из них на питательных средах штаммов МБТ. В процессе исследований было разработано предлагаемое средство, отличие которого состоит в том, что известный биочип «ТБ-Биочип (РИФ)» используется по новому назначению для определения чувствительности L-форм МБТ к лекарственному препарату рифампицину. Предлагаемое средство было разработано в процессе исследования 414 образов диагностического материала от больных впервые выявленным туберкулезом легких. Результаты этого исследования представлены в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, в 18 случаях из одного и того же диагностического материала были одновременно выделены и бактериальные, и L-формы МБТ. Для контроля результатов определения лекарственной чувствительности L-форм к рифампицину использовали данные параллельного определения чувствительности 18 бактериальных штаммов МБТ, выделенных из того же диагностического материала. Лекарственную чувствительность бактериальных форм МБТ к рифампицину определяли стандартным методом абсолютных концентраций и параллельно методом биологических микрочипов на «ТБ-Биочип (РИФ)», L-форм – только методом биологических микрочипов на «ТБ-Биочип (РИФ)». Результаты этого исследования представлены в таблице 2. Как следует из таблицы 2, у 17 (94,4%) из 18 параллельно исследованных штаммов МБТ и L-форм отмечено полное совпадение результатов определения лекарственной чувствительности обоими методами. Один штамм L-форм МБТ (5,5%) оказался чувствительным к рифампицину, тогда как у выделенного из того же материала бактериального штамма МБТ классическим методом и биочипом установлено наличие устойчивости к рифампицину. Таким образом, суммарный процент несовпадения результатов определения лекарственной чувствительности бактериальных и L-форм МБТ составил 5,5%. Для демонстрации клинической значимости предлагаемого способа определения лекарственной чувствительности L-форм МБТ приводим следующее клиническое наблюдение. Больной П., 32 лет, поступил в стационар с диагнозом впервые выявленного инфильтративного туберкулеза верхней доли правого легкого с наличием полости распада и обсеменения. При микробиологическом и молекулярно-биологическом исследованиях бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и 3 порций мокроты выделить бактериальные формы МБТ не удалось. Обнаружены только L-формы МБТ (см. Методические рекомендации – стр.4). С помощью биологического микрочипа «ТБ-Биочип (РИФ)» в rpoB-гене ДНК L-форм была выявлена мутация, что свидетельствовало о наличии у больного лекарственной устойчивости к наиболее эффективному противотуберкулезному препарату – рифампицину. На основании полученных лабораторных данных на 4-ые сутки пребывания больного в клинике была произведена коррекция первоначально назначенного химиотерапевтического режима с отменой ранее назначенного рифампицина и введением в схему лечения резервного препарата протионамида. Это способствовало эффективному лечению и впоследствии сравнительно быстрому излечению больного. ЛИТЕРАТУРА Формула изобретения
Применение биологического микрочипа «ТБ-Биочип (РИФ)» для определения лекарственной чувствительности L-форм Mycobacterium tuberculosis к рифампицину.
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 17.12.2005
Извещение опубликовано: 27.01.2007 БИ: 03/2007
|
||||||||||||||||||||||||||
