Патент на изобретение №2263142

Published by on




РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ



ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,
ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ
(19) RU (11) 2263142 (13) C2
(51) МПК 7
C12N1/20
C12N1/20, C12R1:00
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

Статус: по данным на 18.01.2011 – прекратил действие

(21), (22) Заявка: 2003121624/13, 14.07.2003

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

14.07.2003

(43) Дата публикации заявки: 27.01.2005

(45) Опубликовано: 27.10.2005

(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске:
БАЗИКОВ И.А. Л-трансформация бруцелл. Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций. Тезисы докладов областной научной конференции молодых ученых, 17-20 октября 1989 г. Ростов-на-Дону, 1989, с.5-8. RU 2148638 С1, 10.05.2000. ОСТРОВСКАЯ Н.Н. К вопросу об образовании у бруцелл L-форм в условиях искусственной питательной среды. Журн. микробиол., 1972, №4, с.108-112.

Адрес для переписки:

664047, г.Иркутск, ул. Трилиссера, 78, НИПЧИ Сибири и ДВ

(72) Автор(ы):

Михайлов Л.М. (RU),
Калиновский А.И. (RU),
Андреевская Н.М. (RU),
Голубинский Е.П. (RU),
Михайлова В.А. (RU),
Репина Л.П. (RU),
Балахонов С.В. (RU),
Шестопалов М.Ю. (RU),
Болдина А.А. (RU),
Татарникова О.Г. (RU),
Капустин Ю.М. (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока (НИПЧИ Сибири и ДВ) (RU)

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-СУБКУЛЬТУР ШТАММА BRUCELLA ABORTUS И-206

(57) Реферат:

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в иммунологии. Предложенное изобретение характеризует способ получения L-субкультур Brucella abortus И-206. Способ предусматривает пассирование бруцелл штамма Brucella abortus И-206 на питательной среде, содержащей печеночный настой, нормальную лошадиную сыворотку, агар-агар, натрия хлорид, сульфат магния, сахарозу, глицерин с добавлением в питательную среду бициллина-3 в нарастающих концентрациях, при следующем соотношении компонентов, мас.%: агар-агар – 1,2; натрия хлорид – 0,1; магния сульфат – 0,05; сахароза – 10; глицерин – 1,0; нормальная лошадиная сыворотка – 10; печеночный настой – остальное, где бициллин-3 добавляют в питательную среду в нарастающих концентрациях от 10 до 9000 ЕД/мл среды. Данный способ позволяет получить L-субкультуры бруцелл при конечной концентрации бициллина-3 2000 ЕД/мл среды, которые при однократном внутривенном введении кроликам вызывают выработку специфических неполных антител, выявляемых в реакции Кумбса в титре 1:400. При конечной концентрации бициллина-3 9000 Ед/мл среды получают L-субкультуры бруцелл, которые при однократном внутривенном введении кроликам вызывают выработку специфических агглютининов, выявляемых в реакции агглютинации в титре 1:1600. Изобретение может найти применение в иммунологии с целью получения высокоактивных и высокоспецифичных сывороток бруцелл L-форм. 2 табл.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности к микробиологии и иммунологии, и может быть использовано для получения L-субкультур В.abortus, обладающих высокой антигенной активностью и специфичностью и применяемых для приготовления антигена при получении диагностических сывороток, а также определения специфических антител против бруцелл в L-форме в сыворотках крови людей и животных.

Известно, что бруцеллы в L-форме обладают слабыми иммуногенными свойствами и вызывают образование специфических антител (AT), определяемых в сыворотках крови в реакции агглютинации (РА) в низких титрах, не превышающих 1:640, поэтому получение субкультур бруцелл в L-форме с целью приготовления антигена (АГ) для иммунизации при получении высокоактивных и высокоспецифичных сывороток является актуальной задачей.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения L-субкультур В.abortus 149, 318, включающий использование среды, содержащей в основе полужидкий триптический перевар бычьих сердец, 10-20% сахарозу, 0,05-5% сульфат магния, 0,01-1% натрия хлорид, 15-25% лошадиную сыворотку, 1% глицерин, 0,01-0,03% налидиксовую кислоту, а в качестве трансформирующего агента бициллин-3 от 50 до 20000 ЕД/мл и глицин от 0,1% до 3%. Однако полученные по данному способу L-субкультуры бруцелл отличаются сниженными, а иногда и полностью утраченными антигенными свойствами. Антисыворотка, полученная с помощью данных L-субкультур бруцелл, была недостаточно специфична, так как агглютинировала исходные бактериальные S-формы в разведении 1:320, а гомологичный L-антиген – 1:640, что свидетельствует о сохранении выраженных антигенных связей с исходным родительским штаммом (Базиков И.А. Л-трансформация бруцелл. / Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций. Тезисы докладов областной научной конференции молодых ученых, 17-20 октября 1989 г., Ростов-на-Дону, 1989, стр.5-8.) Кроме того, данный способ достаточно дорог.

Целью изобретения является получение L-субкультур бруцелл, обладающих высокой антигенностью и специфичностью, удешевление способа.

Поставленная цель достигается многократным пассированием штамма В.abortus И-206 в S-форме из коллекции живых культур Иркутского НИПЧИ, отличающегося высокой антигенной активностью и высокой резистентностью к антибиотикам пенициллинового ряда на среде, содержащей трансформирующий агент. Состав среды включает: печеночный настой, агар-агар, натрия хлорид, магния сульфат, сахарозу, глицерин, нормальную лошадиную сыворотку при следующем соотношении компонентов, мас.%:

агар-агар 1,2
натрия хлорид 0,1
магния сульфат 0,05
сахароза 10
глицерин 1,0
нормальная лошадиная сыворотка 10
печеночный настой остальное

Для получения L-субкультур, обладающих способностью при однократном введении животным вызывать у них выработку неполных антител исходный штамм В.abortus И-206 пятикратно пассируют на питательной среде, в которую добавляют бициллин-3 в нарастающих концентрациях: 10-50-100-1000-2000 ЕД/мл среды, а для получения L-субкультур, вызывающих при однократном введении животным выработку агглютининов, проводят двенадцатикратное пассирование на питательной среде с концентрациями бициллина-3: 10-50-100-1000-2000-3000-4000-5000-6000-7000-8000-9000 ЕД/мл среды.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается от известного тем, что для получения L-субкультур используют многократное пассирование штамма В.abortus И-206 на питательной среде, содержащей печеночный настой, агар-агар, натрия хлорид, магния сульфат, сахарозу, глицерин, нормальную лошадиную сыворотку, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

агар-агар 1,2
натрия хлорид 0,1
магния сульфат 0,05
сахароза 10
глицерин 1,0
нормальная лошадиная сыворотка 10
печеночный настой остальное

При многократном пассировании в питательную среду добавляют бициллин-3 в концентрациях: 10-50-100-1000-2000-3000-4000-5000-6000-7000-8000-9000 ЕД/мл среды.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения «новизна».

Проведенный анализ патентной и научно-технической литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и других технических решений в данной и смежной областях. Так, авторами не найден способ получения L-субкультур штамма В.abortus И-206, включающий предлагаемые режимы. А именно данные режимы позволяют достичь поставленной цели – получить L-субкультуры штамма В.abortus И-206, обладающие высокой антигенной активностью и специфичностью, которые используют для приготовления АГ, который при введении кроликам вызывает выработку высокоактивных и высокоспецифичных AT, а при исследовании сывороток крови людей и животных выявляет AT против бруцелл в L-форме. Кроме того, данный способ более дешев, так как не требует специального оборудования и дорогостоящих реактивов и может быть осуществлен в обычных лабораторных условиях, а также в производстве иммунобиологических препаратов.

Таким образом, данный способ соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом:

Берут штамм В.abortus И-206 и проводят L-трансформацию путем многократного пассирования на питательной среде, содержащей печеночный настой, агар-агар, натрия хлорид, магния сульфат, сахарозу, глицерин, нормальную лошадиную сыворотку, при следующем соотношении компонентов, мас.%: агар-агар – 1,2, натрия хлорид – 0,1, магния сульфат – 0,05, сахароза – 10, глицерин – 1,0, нормальная лошадиная сыворотка – 10, печеночный настой – остальное. Бициллин-3 добавляют в питательную среду при многократном пассировании в нарастающих концентрациях: 10-50-100-1000-2000-3000-4000-5000-6000-7000-8000-9000 ЕД/мл среды. Для получения L-субкультуры, обладающей способностью при однократном введении животным вызывать выработку неполных антител, штамм В.abortus И-206 пассируют на питательной среде до концентрации бициллина-3 2000 ЕД/мл (пятый пассаж). Для получения L-субкультуры, вызывающей при однократном введении животным выработку агглютининов, пассирование проводят на питательной среде до концентрации бициллина-3 9000 ЕД/мл среды (12-ый пассаж). Для получения бактериальной массы L-субкультуры 5 и 12 пассажей высевают на флаконы с питательной средой и соответствующим пассажу содержанием антибиотика. После выращивания бактериальную массу L-субкультур смывают физиологическим раствором рН 7,2-7,4, определяют концентрацию микробных клеток по отраслевому стандартному образцу мутности бактериальных взвесей (ОСО 42-28-59-85) в 10 ед. Для приготовления антигена бактериальную массу инактивируют добавлением 2,5% формалина и выдерживают в течение 24 часов. Полученный таким способом антиген контролируют на специфическую стерильность.

Изменения биологических свойств L-субкультур В.abortus И-206 5 и 12 пассажей по сравнению с исходной культурой и референтными штаммами бруцелл приведены в таблице 1. При фазово-контрастном микроскопировании в мазках L-субкультур бруцелл 5 и 12 пассажей наблюдается полиморфная морфологическая картина, включающая присутствие значительного количества шаровидных и нитевидных форм. Полученные L-субкультуры не теряют своих свойств в течение двух лет (срок наблюдения). Результаты ПЦР свидетельствуют о том, что исследуемые микроорганизмы в S- и L-формах относятся к роду бруцелл. В качестве праймеров используют олигонуклеотиды, ограничивающие фрагмент хромосомной ДНК бруцелл всех видов в 269 пар нуклеотидов. Последовательности праймеров: Bru 1 (5′ – GCA GTC AGA CGT TGC СТА TT – 3′); Bru 2 (5′ – GCT TCA GGT GTT CAG CCT Т – 3′). В качестве положительного контроля используют клеточную суспензию В.abortus И-206 (S-форма), в качестве отрицательного – дистиллированную воду. Программу амплификации: 94°С – 35 сек, 52°С – 35 сек, 72°С – 35 сек, из 40 циклов, осуществляют на многоканальном амплификаторе «МС-2» (ЗАО «ДНК технология». Москва). Для проверки антигенных свойств L-субкультур В.abortus И-206 5 и 12 пассажей используют экспериментальных животных (кролики породы шиншилла), которым внутривенно вводят по 1 мл суспензии живых клеток L-субкультур в дозе 109 м.к. Через 7 суток животным проводят кровопускание и получают иммунные сыворотки. Об антигенной активности полученных L-субкультур судят по титру специфических AT в сыворотках крови зараженных животных, выявляемых в реакциях Кумбса (РК) и РА. Специфичность полученных антигенов из L-субкультур В.abortus И-206 5 и 12 пассажей проверяют в РА с различными сыворотками (таблица 2). Как видно из результатов, представленных в таблице 2, о высокой антигенной активности L-субкультур штамма В.abortus И-206 5 и 12 пассажей свидетельствует тот факт, что антисыворотка, полученная против L-субкультуры 5 пассажа, содержит неполные AT, которые дают положительный результат в РК с L-субкультурами 5 и 12 пассажей в титре 1:400. Эти же L-субкультуры не взаимодействуют в РА. Антисыворотка, полученная против L-субкультуры 12 пассажа, содержит агглютинины, которые положительно реагируют в РА с L-субкультурами 5 и 12 пассажей в титре 1:1600. О высокой специфичности полученных L-субкультур В.abortus И-206 свидетельствуют позитивные результаты в РК (1:400) и РА (1:1600) с гомологичными антисыворотками и отрицательные – в РА с сыворотками: экспериментальной против исходного штамма В.abortus И-206 в S-форме; коммерческими: туляремийной, холерной «О», холерной «Огава», иерсиниозными 0:9 и 0:3. При этом исходная S-культура В.abortus И-206 положительно реагировала в РА с сыворотками: экспериментальной против исходного штамма B.abortus И-206 в S-форме (1:3200); коммерческими: туляремийной, холерной «О», холерной «Огава» и иерсиниозной 0:3 (1:40), иерсиниозной 0:9 (1:1600) и не взаимодействовала с экспериментальными сыворотками против L-субкультур В.abortus И-206 5 и 12 пассажей.

Пример 1.

Берут штамм В.abortus И-206 в S-форме и получают L-субкультуру пятого пассажа путем многократного пассирования на питательной среде, содержащей печеночный настой, агар-агар, натрия хлорид, магния сульфат, сахарозу, глицерин, нормальную лошадиную сыворотку при следующем соотношении компонентов, мас.%: агар-агар – 1,2, натрия хлорид – 0,1, магния сульфат – 0,05, сахароза – 10, глицерин – 1,0, нормальная лошадиная сыворотка – 10, печеночный настой – остальное. Бициллин-3 добавляют в питательную среду в нарастающих концентрациях: 10-50-100-1000-2000 ЕД/мл среды. Для получения бактериальной массы L-субкультуры пятого пассажа осуществляют операции, как описано выше.

Пример 2.

Берут штамм В.abortus И-206 в S-форме и получают L-субкультуру 12 пассажа путем многократного пассирования на питательной среде, содержащей печеночный настой, агар-агар, натрия хлорид, магния сульфат, сахарозу, глицерин, нормальную лошадиную сыворотку при следующем соотношении компонентов, мас.%: агар-агар – 1,2, натрия хлорид – 0,1, магния сульфат – 0,05, сахароза – 10, глицерин – 1,0, нормальная лошадиная сыворотка – 10, печеночный настой – остальное. Бициллин-3 добавляют в питательную среду в нарастающих концентрациях: 10-50-100-1000-2000-3000-4000-5000-6000-7000-8000-9000 ЕД/мл среды. Для получения бактериальной массы L-субкультуры бруцелл 12 пассажа осуществляют операции, как описано выше.

Полученные по данному способу L-субкультуры 5 и 12 пассажей штамма В.abortus И-206 обладают высокой антигенной активностью, так как при однократном внутривенном введении кроликам вызывают образование специфических антител, выявляемых в сыворотках крови в РК в титрах 1:400 (5 пассаж) и в PA – 1:1600 (12 пассаж) и высокой специфичностью, о чем свидетельствуют отрицательные результаты в РА L-субкультур с сыворотками: экспериментальной против исходного штамма В.abortus И-206 в S-форме; коммерческими: туляремийной, холерной «О», холерной «Огава», иерсиниозными 0:9 и 0:3. Приготовленный по предлагаемому способу из L-субкультур инактивированный АГ технологичен, так как проведение иммунизации животных или постановка серологических реакций при выявлении специфических AT в сыворотках крови людей и животных не требует организации специальных мер по защите работающего персонала от заражения бруцеллезом. По сравнению с прототипом данный способ позволяет получить L-субкультуры бруцелл, обладающие более высокой антигенной активностью и специфичностью, введение которых животным вызывает образование специфических AT в более высоких титрах в РА 1:1600 и в РК 1:400, в прототипе в PA – 1:640, при этом антисыворотки, полученные против предлагаемых L-субкультур В.abortus И-206, не взаимодействуют в РА с исходным штаммом в S-форме, в прототипе – в титре 1:320. О высокой специфичности предлагаемых L-субкультур свидетельствуют отрицательные результаты РА с сыворотками, дающими перекрестные реакции с бруцеллами в S-форме, коммерческими: туляремийной, холерной «О», холерной «Огава», иерсиниозными 0:9 и 0:3. Антиген, приготовленный из L-субкультур В.abortus И-206 5 и 12 пассажей, используют для получения высокоактивной и высокоспецифичной диагностической сыворотки для детекции бруцелл в L-форме, а также для определения специфических AT к бруцеллам в L-форме в сыворотках крови людей и животных.

Кроме того, предлагаемый способ получения L-субкультур бруцелл по сравнению с прототипом более дешев.

Таблица 1
Биологические свойства бруцелл в S- и L-формах
Штаммы Лизис фагом ТБ Диссоциация Бактериостатаческие свойства Агглютинабельность Продукция сероводорода (мм) Уреазная активность (на среде Кристенсена)
реакция с трипафлавином реакция термопреципитации тионин фуксин сыворотка поливалентная сыворотки моноспецифиче-ские 1 сутки 2 сутки 3 сутки 20 мин 2 часа 5 часов 24 часа
1:25 тыс. 1:50 тыс. 1:100 тыс. 1:50 тыс. 1:100 тыс. А M
В.m.16M + + + + + 1:1600 1:160 3 3 3 Сл. Сл. +++
В.а.544 + + + 1:1600 1:40 Сл. Сл. 2
В.suis 1330 + + + 1:1600 1:40 6 5 5 + ++ +++ ++++
В.а.И-206
S-форма
+ + + 1:1600 1:80 1 Сл. Сл. Сл. +++
В.а.И-206
L-форма (5 пассаж)
+ + + + + + + *1:100 + ++ +++ ++++
В.а.И-206
L-форма (12 пассаж)
+ + + + + + + *1:100 ± ++ +++
Примечание:
– результат взаимодействия не типичный (отсутствует зонтик, надосадочная жидкость мутная, образование тяжей)
В.а. – В.abortus
B.m. – В.melitensis
Сл. – следовые количества
А – антиабортус
М – антимелитензис

Таблица 2
Специфичность бруцеллезных S- и L-антигенов в реакциях агглютинации и Кумбса
Сыворотки Антигены
В.abortus И-206 в L-форме (5 пассаж) В.abortus И-206 в L-форме (12 пассаж) В.abortus И-206 в S-форме
Экспериментальная против В.abortus И-206 в S-форме Отр.* Отр.* 1:3200*
Экспериментальная против В.abortus И-206 в L-форме (5 пассаж) 1:400**
Отр.*
1:400**
Отр.*
Отр.**
Отр.*
Экспериментальная против В. abortus И-206 в L-форме (12 пассаж) 1:1600* 1:1600* Отр.*
Коммерческая туляремийная Отр.* Отр.* 1:40*
Коммерческая холерная «О» Отр.* Отр.* 1:40*
Коммерческая холерная «Огава» Отр. * Отр.* 1:40*
Коммерческая иерсиниозная 0:9 Отр.* Отр.* 1:1600*
Коммерческая иерсиниозная 0:3 ±* Отр.* 1:40*
Примечание:
* результат реакции агглютинации
** результат реакции Кумбса

Формула изобретения

Способ получения L-субкультур B.abortus, включающий пассирование бруцелл на питательной среде, содержащей натрия хлорид, сульфат магния, сахарозу, глицерин, нормальную лошадиную сыворотку и бициллин-3 в нарастающих концентрациях, отличающийся тем, что используют штамм B.abortus И-206, а питательная среда дополнительно содержит печеночный настой и агар-агар при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Агар-агар 1,2
Натрия хлорид 0,1
Магния сульфат 0,05
Сахароза 10
Глицерин 1,0
Нормальная лошадиная сыворотка 10
Печеночный настой Остальное

а бициллин-3 добавляют в питательную среду в нарастающих концентрациях от 10 до 9000 ЕД/мл среды.


MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 15.07.2005

Извещение опубликовано: 20.09.2006 БИ: 26/2006


Categories: BD_2263000-2263999