Патент на изобретение №2262947

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБИНОПОДОБНОГО КОАГУЛИРУЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для исследования крови. Способ, заключается в хроматографической очистке яда змеи, идентификации и смешивания фракций, содержащих тромбиноподобный фермент, с последующим выделением целевого продукта хроматографией на Sepharose, уравновешенной Трис-HCL буферным раствором, при этом яд змеи Agkistrodon halys в 0,05 М растворе натрия хлорида хроматографируют на колонке, заполненной Sephacryl S-300 HR, после идентификации и смешивания фракций с тромбиноподобным ферментом их концентрируют ультрафильтрацией с отбором по молекулярной массе 10 Кд, полученный раствор хроматографируют на колонке с DEAE Sepharose FF, уравновешенной ацетатным буферным раствором, отбирают и смешивают фракции с тромбиноподобным ферментом, повторно концентрируют ультрафильтрацией, затем концентрат хроматографируют на колонке с гелем SP Sepharose FF, фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, разводят дистиллированной водой до активности 12-15 с в тесте тромбинового времени, вносят сахарозу, азид натрия до 0,01%, разливают во флаконы и лиофильно высушивают. Способ обеспечивает расширение арсенала реагентов для лабораторной диагностики нарушений в системе гемостаза. Фракция, выделенная из яда змеи Agkistrodon halys, обитающей на территории Российской Федерации, не уступает по своим коагулирующим свойствам известной фракции из яда змеи Bothrops atrox.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для исследования крови.

Известно, что тромбиноподобный фермент (ТФ) используют для диагностики дисфибриногенемий и гипофибриногенемий, определения уровня фибриногена и для контроля гепаринотерапии.

Наиболее близким по достигаемому положительному результате является способ получения ТФ из яда змеи Bothrops atrox (семейство Bothrops, род atrox), заключающийся в выделении тромбиноподобной фракции, способной вызывать коагуляцию фибриногена [Holleman W.H., Weiss L.J., The thrombin-like enzyme from Bothrops atrox snake venom. Properties of the enzyme purified by affinity chromatography on p-aminobenzamidine-substituted agarose. J Biol. Chem. 1976, Mar. – 25. – 251(6). – Р.1663-9]. Такой реагент под названием «Reptilase®» запатентован фирмой Pentapharm Ltd (Швейцария).

К недостаткам известного способа следует отнести малую доступность и высокую стоимость яда змеи Bothrops atrox, не встречающейся на территории Российской Федерации, обитающей преимущественно в странах Южной Америки.

Положительным результатом заявляемого способа является расширение арсенала реагентов для лабораторной диагностики нарушений в системе гемостаза.

Положительный результат заявляемого способа достигается тем, что в качестве источника коагулирующей тромбиноподобной фракции используют яд змеи Agkistrodon halys (семейство Agkistrodon, род halys), обитающей на территории Российской Федерации.

Способ осуществляют следующим образом:

Реактивы и оборудование:

1. Яд змеи Agkistrodon halys (семейство Agkistrodon; род halys), 0,01 г, кристаллический.

2. Ацетатцеллюлозные мембраны с отбором (отсечкой) по молекулярной массе 10 Кд (Sartorius, Германия).

3. Ячейки для ультрафильрации (Ultrasart Cell 50, Sartorius, Германия).

4. Раствор NaCl (0,05 M).

5. TRIS-HCl буфер (0,02 М, рН=8,1).

6. Ацетатный буфер, (0,025 М, рН=5,5).

7. Гель Sephacryl S-300 HR (Pharmacia, Швеция).

8. Гель DEAE Sepharose FF (Pharmacia, Швеция).

9. Гель SP Sepharose FF (Pharmacia, Швеция).

10. Гель Sephadex G-25 (M) (Pharmacia, Швеция).

11. Референтная нормальная плазма (РНП), лиофильно высушенная фирмы “Технология-Стандарт”, Россия.

12. Азид натрия (Sigma, США).

13. Сахароза, 2% раствор (Merk, Германия).

14. Пробирки стеклянные вместимостью 20 мл.

15. Пенициллиновые флаконы на 10 мл.

16. Хроматографические колонки (размером 26×800 мм, 26×40 мм, 20×26 мм и 15×200 мм), производитель (Pharmacia, Швеция).

17. Весы аналитические S-2051 (Sartorius, Германия).

18. Магнитная мешалка MM 3M, Россия.

19. Коллектор фракций (LKB, Швеция).

20. Спектрофотометр СФ-46 (Россия).

21. РН-метр РН-340 (Россия).

22. Коагулометр (КС-4, Германия).

Приготовление реактивов

Приготовление раствора яда змеи Agkistrodon hatys: К 100 мг кристаллического яда змеи Agkistrodon halys добавляют 5 мл 0,05 М раствора натрия хлорида (NaCl). Раствор яда змеи Agkistrodon halys перемешивают в течение 60 мин на магнитной мешалке при +18…+25°С. Все последующие процедуры приготовления реактивов и выделения ТФ проводят при той же температуре.

Ход выделения ТФ из яда змеи Agkistrodon hatys

Этап 1. Раствор яда змеи Agkistrodon halys наносят на хроматографическую колонку (размером 26×800 мм), заполненную гелем Sephacryl S-300 HR, уравновешенным 0,05 М раствором натрия хлорида. Элюцию ведут этим же раствором при скорости 60 мл/ч. Объем собираемых фракций – 10 мл.

Этап 2. Содержащие ТФ фракции элюата идентифицируют в тромбиновом тесте. Для этого в регистрирующую ячейку коагулометра вносят 0,1 мл контрольной нормальной плазмы (инкубируют 60 с при +37°С) и 0,1 мл исследуемой фракции (в контроле тот же объем элюирующего буфера) и регистрируют время образования сгустка. При наличии во фракции ТФ время свертывания укорачивается (степень укорочения зависит от концентрации ТФ), по сравнению с контролем, где 0,1 мл исследуемой фракции заменен на 0,1 мл элюирующего буфера.

Этап 3. Содержащие ТФ фракции элюата смешивают и концентрируют методом ультрафильтрации до 1/10 от исходного объема фракций. Для концентрирования образцов используют ячейки для ультрафильрации и ацетатцеллюлозные мембраны с отбором по молекулярной массе 10 Кд.

Этап 4. Полученный раствор разводят в 10 раз Ацетатным буфером и наносят на колонку (размерами 26×40 мм), заполненную гелем DEAE Sepharose FF, который уравновешивают тем же буфером. Элюцию ведут 0,025 М Ацетатным буфером, содержащим линейный градиент хлорида натрия (NaCl) от 0,0 до 0,6 М, со скоростью 450 мл/ч. Объем собираемых фракций 20 мл.

Этап 5. Содержащие ТФ фракции элюата идентифицируют (Этап 2), смешивают и концентрируют методом ультрафильтрации через ацетатцеллюлозные мембраны до 1/20 от исходного объема.

Этап 6. Полученный концентрат фракций, полученных на катионообменнике, разводят в 10 раз буфером TRIS-HCl и наносят на колонку (размерами 20×26 мм), заполненную гелем SP Sepharose FF, уравновешенным тем же буфером. Элюцию ведут TRIS-HCl буфером, содержащим линейный градиент концентрации NaCl от 0,0 до 0,4 М, со скоростью 450 мл/ч. Объем собираемых фракций – 10 мл.

Этап 7. Содержащие ТФ фракции элюата идентифицируют (Этап 2) смешивают и разводят дистиллированной водой до активности 12-15 с в тесте тромбинового времени.

Этап 8. В пул активных фракций вносят сахарозу до 2%, азид натрия до 0,01%, разливают по 1,0 мл в пенициллиновые флаконы и лиофильно высушивают.

В результате получают 10-20 мл (в зависимости от активности исходной партии яда Agkistrodon halys) очищенного тромбиноподобного фермента.

Таким образом, из 100 мг кристаллического яда змеи Agkistrodon halys получают 0,3-0,5 мг ТФ.

Проверка коагулирующих свойств ТФ

Для проверки способности полученного ТФ вызывать коагуляцию исследовали время свертывания РНП, бедной тромбоцитами плазмы больных с гипофибриногенемией (n=12) и 0,2% раствора фибриногена. Для этой цели в регистрирующую ячейку коагулометра вносили 0,1 мл исследуемой плазмы, инкубировали плазму 30 секунд при +37°С и 0,1 мл раствора ТФ (или 0,1 мл Reptilase®) и регистрировали время образования сгустка. В контроле вместо ТФ (или 0,1 мл Reptilase®) добавляли тот же объем дистиллированной воды.

Как видно из таблицы, время свертывания РНП и раствора фибриногена после добавления ТФ не отличается от времени свертывания с Reptilase® (прототип). В это же время добавление дистиллированной воды не вызывало коагулирующего эффекта. При этом в плазме больных с гипофибриногенемией время свертывания с ТФ было удлинено и не отличалось от времени свертывания с реагентом Reptilase®.

Таким образом, полученный ТФ из яда змеи Agkistrodon halys имеет коагулирующие свойства, аналогичные свойствам известной тромбиноподобной фракции из яда змеи Bothrops atrox (Reptilase®).

Формула изобретения

Способ получения тромбиноподобного коагулирующего фермента, заключающийся в хроматографической очистке яда змеи, идентификации и смешивании фракций, содержащих тромбиноподобный фермент, с последующим выделением целевого продукта хроматографией на Sepharose, уравновешенной Трис-HCL буферным раствором, отличающийся тем, что яд змеи Agkistrodon halys в 0,05 М растворе натрия хлорида хроматографируют на колонке, заполненной Sephacryl S-300 HR, после идентификации и смешивания фракций с тромбиноподобным ферментом их концентрируют ультрафильтрацией до 1/10 от исходного объема на ацетатцеллюлозных мембранах с отбором по молекулярной масс 10 Кд, полученный раствор хроматографируют на колонке с DEAE Sepharose FF, уравновешенной ацетатным буферным раствором, отбирают и смешивают фракции с тромбиноподобным ферментом, затем концентрируют ультрафильтрацией до 1/20 от исходного объема, концентрат после разведения в Трис-HCL буферном растворе хроматографируют на колонке с гелем SP Sepharose FF, фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, разводят дистиллированной водой до активности 12-15 с в тесте тромбинового времени, вносят сахарозу, азид натрия до 0,01%, разливают во флаконы и лиофильно высушивают.