Патент на изобретение №2262705

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕМОГЛОБИНОВОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий. Сущность изобретения состоит в том, что выращивают исследуемую культуру микроорганизмов, из выросшей культуры готовят взвесь, инкубируют, отделяют супернатант, смешивают его с раствором гемоглобина, параллельно готовят контрольную пробу, опытную и контрольную пробы инкубируют, пробы добавляют в трансформирующий раствор и инкубируют, затем определяют остаточную концентрацию гемоглобина в опытной и контрольной пробах и определяют антигемоглобиновую активность исследуемой культуры микроорганизмов. Техническим результатом является определение антигемоглобиновой активности микроорганизмов, установление их патогенных характеристик и этиологической значимости при патологических процессах. 2 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”proteins adsorbed to a hydrophobic surface are used as substrates. Appi. Environ. Microbiol. 1983, Feb; 45 (2), p.393-400.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в исследовательской работе НИИ и практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений, определяющих патогенные характеристики микроорганизмов для установления их этиологической значимости при патологических процессах.

Актуальность разработки способа определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов определяется возможностью изучения одного из факторов патогенности микроорганизмов, а также повышения точности диагностики и прогнозирования развития у больных анемии при заболеваниях инфекционной этиологии.

Задачей заявляемого технического решения является создание способа определения антигемоглобиновой активности (АнтиHbA) микроорганизмов.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на мясопептонном агаре, из выросшей культуры готовят одномиллиардную взвесь, добавляют мясопептонный бульон, инкубируют, отделяют супернатант центрифугированием, смешивают его с раствором гемоглобина, параллельно готовят контрольную пробу из мясопептонного бульона и раствора гемоглобина, опытную и контрольную пробы инкубируют, далее каждую из проб добавляют в трансформирующий раствор и инкубируют, затем определяют остаточную концентрацию гемоглобина в опытной и контрольной пробах и определяют антигемоглобиновую активность исследуемой культуры микроорганизмов по формуле:

АнтиHbA=С_к-С_о,

где АнтиHbA – антигемоглобиновая активность в граммах инактивированного гемоглобина на литр супернатанта (г/л);

С_к – концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

С_о – концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Авторами экспериментально установлено, что микроорганизмы, независимо от их таксономического разнообразия, способны инактивировать гемоглобин крови человека. Было изучено 50 клинических штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий. Изучаемые штаммы S.aureus, S.epidermidis, S.cohnii, S.saprophyticus, B.cereus, E.coli, выделенные у людей из очага локализованной гнойно-воспалительной инфекции, выращивали на мясопептонном агаре при t=37°C в течение 24 часов, готовили их взвеси на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд КОЕ/мл. Добавили мясопептонный бульон и инкубировали при t=37°C в течение 24 часов. Затем получали бесклеточный супернатант каждого микроорганизма центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут и смешивали с раствором гемоглобина в концентрации 120 г/л из набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (ТУ 9398-280-11498242-00). В качестве контроля брали раствор мясопептонного бульона с раствором гемоглобина вышеуказанной концентрацией. Затем опытную и контрольную пробы инкубировали 3 часа при t=37°C, после этого каждую из проб добавляли в трансформирующий раствор (смесь натрия углекислого кислого, калия железосинеродистого и ацетонциангидрина), тщательно перемешивали, инкубировали при t=18-25°C в течение 20 минут и с помощью фотометра ИФА-ОЭП (длина волны 492 нм, синий светофильтр) определяли оптическую плотность. Далее в опыте и контроле определяли остаточную концентрацию гемоглобина по формулам, взятым из инструкции определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (ТУ 9398-280-11498242-00), затем по разнице концентраций гемоглобина в опытной пробе и контрольной определяли антигемоглобиновую активность исследуемого микроорганизма. АнтиHbA выражают в граммах инактивированного гемоглобина на литр супернатанта (г/л). Результаты исследования представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, все изученные штаммы способны инактивировать гемоглобин крови человека, но уровень количества инактивируемого гемоглобина у выделенных штаммов различен. Наиболее высоким уровенем АнтиHbA обладали штаммы S.aureus и E.coli, с уровнем выраженности АнтиHbA 8,9±3,8 (г/л) и 7,5±3,2 (г/л) соответственно.

Авторами установлена взаимосвязь между концентрацией гемоглобина в крови у людей с локализованной гнойно-воспалительной инфекцией и уровнем антигемоглобиновой активности микроорганизмов. Исследования показали, что чем выше уровень антигемоглобиновой активности микроорганизмов, выделенных из очага локализованной гнойно-воспалительной инфекции, тем ниже концентрация гемоглобина у больных, что приводит к развитию анемии инфекционной этиологии. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, среди больных, у которых концентрация гемоглобина крови была в норме (120-130 г/л), преобладали штаммы микроорганизмов с низким уровнем антигемоглобиновой активности (3 г/л), тогда как среди больных, у которых концентрация гемоглобина была ниже нормы (80-90 г/л), выделялись штаммы микроорганизмов с высоким уровнем АнтиHbA (>3 г/л). Причем среди больных, у которых концентрация гемоглобина была в норме, выделялись штаммы микроорганизмов с низким уровнем АнтиHbA в 6,8 раз чаще, а штаммы микроорганизмов с высоким уровнем АнтиHbA в 3,2 раза реже, чем среди больных, у которых концентрация гемоглобина была ниже нормы.

Для осуществления способа используется набор реактивов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом «Гемоглобин-агат» (ТУ 9398-280-11498242-00), производства фирмы «Агат-мед» (Россия).

Способ осуществляется следующим образом:

1) Исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на мясопептонном агаре при 37°С в течение 24 часов.

2) Из выросшей культуры готовят одномиллиардную взвесь на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд КОЕ/мл, отбирают 0,1 мл и добавляют 2,9 мл мясопептонного бульона, инкубируют 24 часа при 37°С.

3) Отделяют супернатант от микробных клеток исследуемой культуры центрифугированием (3000 об/мин в течение 20 минут).

4) Супернатант объемом 0,2 мл смешивают с 0,02 мл раствора гемоглобина. Раствор гемоглобина с концентрацией 120 г/л берется из набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом;

5) Параллельно готовят контрольную пробу – к 0,2 мл мясопептонного бульона добавляют 0,02 мл раствора гемоглобина с концентрацией 120 г/л из набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом.

6) Инкубируют опытную и контрольную пробы в течение 3 часов при 37°С.

7) После инкубации опытную и контрольную пробы объемом 0,02 мл добавляют к 5 мл трансформирующего раствора (смесь натрия углекислого кислого, калия железосинеродистого и ацетонциангидрина), тщательно перемешивают и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре 18-25°С.

8) Проводят измерение оптической плотности в опыте и контроле на фотометре ИФА-ОЭП (длина волны 492 нм, синий светофильтр), затем определяют остаточную концентрацию гемоглобина в опытной и контрольной пробах по формулам, взятым из инструкции по определению гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (ТУ 9398-280-11498242-00):

С_о=E_о/E_кб·120, С_к=Е_к/Е_кб·120,

где С_о– концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л;

С_к – концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

E_о – оптическая плотность опытной пробы;

E_к – оптическая плотность контрольной пробы;

Е_кб – оптическая плотность калибровочной пробы;

120 – концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.

9) Определяют антигемоглобиновую активность исследуемой культуры микроорганизмов по формуле:

АнтиHbA=С_к-С_о,

где АнтиHbA – антигемоглобиновая активность в граммах инактивированного гемоглобина на литр супернатанта (г/л);

С_к – концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

С_о – концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л.

Антигемоглобиновую активность выражают в граммах инактивированного гемоглобина на литр супернатанта (г/л).

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Больной Т., 4 года. Поступил в ОЦДХ с диагнозом: «Гангренозно-перфоративный аппендицит. Периаппендикулярный абсцесс». Из очага инфекции был выделен штамм S.aureus. Была изучена способность выделенного штамма инактивировать гемоглобин. Для этого приготовили взвесь суточной исследуемой культуры микроорганизма на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд. КОЕ/мл. 0,1 мл взвеси поместили в 2,9 мл мясопептонного бульона и инкубировали 24 часа при 37°С. Затем 0,2 мл супернатанта исследуемой культуры смешивали с 0,02 мл раствора гемоглобина с концентрацией 120 г/л, который берется из набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (ТУ 9398-280-11498242-00). За контрольную пробу принимали раствор мясопептонного бульона объемом 0,2 мл с 0,02 мл раствором гемоглобина вышеуказанной концентрацией. Контроль и опыт инкубировали 3 часа при 37°С. Затем каждую пробу объемом 0,02 мл добавляли в трансформирующий раствор (смесь натрия углекислого кислого, калия железосинеродистого и ацетонциангидрина) объемом 5 мл, тщательно перемешивали и инкубировали 20 минут при t=18-25°C. После этого замеряли оптическую плотность обеих проб на фотометре ИФА-ОЭП (длина волны 492 им, синий светофильтр) и определяли остаточную концентрацию гемоглобина в опытной и контрольной пробах по формулам:

С_о=0,049/0,180·120 С_о=32,6 (г/л)

С_к=0,061/0,180·120 С_к=41 (г/л)

где С_о – концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л;

С_к – концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

0,049 – оптическая плотность опытной пробы;

0,061 – оптическая плотность контрольной пробы;

0,180 – оптическая плотность калибровочной пробы;

120 – концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.

Антигемоглобиновую активность (АнтиHbA) исследуемого штамма S.aureus определяли по формуле:

АнтиHbA=41-32,6=8,4 г/л,

где 8,4 – антигемоглобиновая активность в граммах инактивированного гемоглобина на литр супернатанта (г/л);

41 – концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

32,6 – концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л.

Так как выделенный из очага гнойно-воспалительной инфекции штамм S.aureus обладал высоким уровнем антигемоглобиновой активности – 8,4 г/л, а при исследовании периферической крови концентрация гемоглобина составила 86 г/л; эр – 3,1; ц.п. – 1,05, было сделано заключение о том, что штамм S.aureus способствовал развитию у ребенка анемии инфекционной этиологии, что позволило назначить этиотропную терапию.

Пример 2. Ребенок С., 3 года. Поступил в ОЦДХ с диагнозом: «Фурункул лица». Из очага воспаления был выделен штамм S.epidermidis. Общий анализ крови показал развитие гипохромной анемии средней степени: Hb – 90 г/л; эр – 3,73; ц.п. – 0,85. Для выяснения роли микроорганизма в развитии анемии было проведено исследование на наличие у выделенного штамма микроорганизма антигемоглобиновой активности. Определение данного свойства у штамма S.epidermidis осуществлялось согласно примеру 1. Выявлено, что у штамма S.epidermidis уровень антигемоглобиновой активности составил 6 г/л. Было сделано заключение о том, что высокий уровень антигемоглобиновой активности штамма S.epidermidis способствовал развитию анемии инфекционной этиологии.

Пример 3. Ребенок Г. 7 лет. Поступил в ОЦДХ с диагнозом: «Гангренозно-перфоративный аппендицит. Разлитой гнойный перитонит». При поступлении больному сделали общий анализ крови, который показал концентрацию гемоглобина в крови в пределах нормы – 124 г/л (норма 120-130 г/л); эр – 3,66; ц.п. – 1,01. Из очага воспаления был выделен штамм E.coli. Была изучена способность выделенного штамма микроорганизма инактивировать гемоглобин согласно примеру 1. Уровень антигемоглобиновой активности у штамма E.coli составил 6,5 г/л. Сделано предположение о возможном развитии у больного анемии инфекционной этиологии. Для контроля через 7 дней провели повторный общий анализ крови, при котором концентрация гемоглобина крови снизилась до 102 г/л, что привело к развитию анемии средней степени. После проведения этиотропной терапии у больного Г. концентрация гемоглобина крови повысилась до нормальных значений – 126 г/л.

Таким образом, заявляемый способ позволяет выявить и изучить новое свойство микроорганизмов – антигемоглобиновую активность как один из возможных факторов патогенности микроорганизмов. Использование предлагаемого способа позволит повысить точность диагностики и прогнозирования развития анемии инфекционной этиологии у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями и назначить этиотропную терапию.

Формула изобретения

Способ определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов, заключающийся в том, что исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на мясопептонном агаре, из выросшей культуры готовят одномиллиардную взвесь, добавляют мясопептонный бульон, инкубируют, отделяют супернатант центрифугированием, смешивают его с раствором гемоглобина, параллельно готовят контрольную пробу из мясопептонного бульона и раствора гемоглобина, опытную и контрольную пробы инкубируют, далее каждую из проб добавляют в трансформирующий раствор и инкубируют, затем определяют остаточную концентрацию гемоглобина в опытной и контрольной пробах и определяют антигемоглобиновую активность исследуемой культуры микроорганизмов по формуле:

АнтиНЬА=С_к-С_о,

где АнтиНЬА – антигемоглобиновая активность в граммах инактивированного гемоглобина на литр супернатанта (г/л);

С_к – концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

С_о – концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л.