Патент на изобретение №2262702
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ СТРЕПТОДЕРМИЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области медицины, в частности к дерматологии, иммунохимии. Образцы сыворотки крови обследуемых тестируются с помощью иммуноферментного анализа на планшетах, покрытых сорбируемыми F(ab)2-фрагментами идиотипических и антиидиотипических антител к ФНО
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ В настоящее время лечение пиококковых поражений кожи, в частности стрептодермии, является одной из актуальных проблем дерматологии. Широкий спектр имеющихся антибактериальных и иммунокорригирующих препаратов примерно в 10-15% случаев не могут обеспечить полного выздоровления и течение заболевания приобретает хронический характер, что приводит к временной потере трудоспособности и возможной инвалидизации (А.А.Каламкарян. Гнойничковые поражения кожи. М.: Медицина, 1984). Резистентность организма к инфекциям во многом обусловлена активностью важнейших провоспалительных цитокинов (А.Ройт с соавт. Иммунология. М.: Мир, 2000) и факторами, влияющими на нее. По мнению ряда авторов (Л.В.Ковальчук, Л.В.Ганковская, Э.И.Рубакова. Система цитокинов. – М.: РГМУ, 1999), ведущее место в формировании как гуморального, так и клеточного антимикробного иммунитета принадлежит в основном фактору некроза опухолей-альфа (ФНО В литературе есть указания на то, что сыворотка крови в норме содержит естественные физиологические а-АТ к ряду цитокинов, таким как ИЛ-1 В то же время такие исследования, в частности, при пиодермиях представляются нам весьма перспективными, особенно принимая во внимание теорию N.Jerne (Jerne N.K. The generative grammar of the immune system. Nobel Lecture, December 1984. – Bioscience Reports (Printed in Great Britain). – 1985. – Vol.5. – P.439-451), согласно которой иммунная система представлена в виде саморегулирующейся сети, состоящей из а-АТ и АИАТ с направленностью практически ко всем антигенам собственного организма. К тому же, если идиотипические а-АТ влияют, как уже было сказано, на активность цитокинов, то и АИАТ, связывающие эти а-АТ, тоже каким-то образом должны влиять на их активность, а тем самым и на клиническую картину самого заболевания. Нами была создана тест-система, которую можно использовать для объективной оценки тяжести течения стрептококковых поражений кожи. С помощью данной тест-системы определяют уровень а-АТ к ФНО В настоящее время оценку тяжести течения стрептококковых поражений кожи проводят с помощью анализа клинической картины заболевания, учитывая жалобы больного, площадь и характер пораженной поверхности (А.А.Каламкарян. Гнойничковые поражения кожи. М.: Медицина, 1984). В то же время выявляемые клинические признаки не всегда соответствуют истинной тяжести происходящих деструктивных процессов, что создает целый ряд сложностей для оптимальной тактики лечебных мероприятий. Предлагаемый нами способ позволяет: – оценивать сывороточный уровень а-АТ к ФНО – оценивать сывороточный уровень АИАТ к ФНО – по полученным данным определять степень тяжести стрептодермии. Таким образом, с помощью предлагаемого способа возможно повысить надежность оценки степени тяжести стрептодермии. Указанное осуществляется с помощью определения уровней а-АТ и АИАТ к ФНО В результате такого обследования выявляются лица с патологически повышенными значениями уровней а-АТ и АИАТ к ФНО Реализация существенных признаков предлагаемого изобретения осуществляется следующим образом. I. На планшеты для иммуноферментного анализа (ИФА) сорбируют ФНО II. На планшеты для ИФА сорбируют антитела (идиотипические) к ФНО III. На планшеты наносят образцы тестируемых сывороток и эталонной сыворотки. IV. Выяляют связывающиеся из тестируемых сывороток антитела (идиотипические или антиидиотипические) с помощью конъюгатов антивидовых (вторичных) антител с ферментом, например пероксидазой хрена. Реакцию в лунках планшета проявляют субстратом, например о-фенилендиамином и Н2О2. V. Обрабатывают полученные данные. Определяют интенсивности реакции в лунках, содержащих тестируемые и эталонную сыворотки. Не вытекает из известного уровня техники тот факт, что по значениям уровней а-АТ и АИАТ к ФНО СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ФНО Получение F(ab)2-фрагментов молекул АИАТ к ФНО Для получения поликлональных антител к ФНО ПРОВЕДЕНИЕ ТВЕРДОФАЗНОГО ИФА 1. Растворы каждого из компонентов тест-системы (F(ab)2-фрагменты идиотипических и антиидиотипических антител к ФНО 2. Удаляют (стряхиванием) из лунок растворы с несвязавшимися компонентами и (без дополнительной отмывки) заливают в них блокирующий буфер (например, 0.5% раствор желатина на 0.15 М NaCl). Инкубируют 1 час при 37°С. 3. Отмывают планшеты отмывочным буфером (с 0.05% твин-20). 4. Вносят на планшеты образцы тестируемых и эталонной сывороток в разведении 1:200 на отмывочном буфере. Инкубируют 12-18 ч при температуре +4°С. 5. Отмывают планшеты отмывочным буфером. 6. Проявление реакции осуществляют следующим образом. Раствор конъюгата пероксидазы хрена (или иного фермента) с антивидовыми антителами к IgG человека вносят во все лунки планшета. Затем планшеты инкубируют 60-90 мин при температуре +37°С или 12-16 ч при температуре +2-4°С, после чего коньюгат удаляют, а планшеты отмывают отмывочным буфером. Сразу после этого в лунки вносят раствор субстрата (например, 0.01-0.05% о-фенилендиамина с 0.001-0.005% перекиси водовода на 0.01-0.05 М цитрат-фосфатном буфере в случае применения пероксидазных конъюгатов). Инкубируют планшеты в темноте 10-20 мин при комнатной температуре. 7. По достижении оптимального уровня окрашивания реакцию останавливают добавлением 0.2-0.4 М серной кислоты. 8. Интенсивность окрашивания оценивают с помощью ИФА-ридера любой модели. 9. Обрабатывают полученные данные. а) Из двух дублирующих друг друга значений результатов реакции эталонной и тестируемых образцов сыворотки выбирают среднее. б) Рассчитывают относительную интенсивность реакции с компонентами тест-системы тестировавшихся сывороток по отношению к реакции эталонной сыворотки (в процентах) по полученным значениям оптической плотности лунок. 10. Интерпретируют полученные данные. В случае если значения уровней a-AT и АИАТ к ФНО В качестве эталонной сыворотки брали пулированную сыворотку здоровых лиц от 16 до 50 лет. Положительный эффект от реализации изобретения сводится к получению описанной тест-системы, с помощью которой можно объективно оценить тяжесть течения стрептококковых поражений кожи. Критерием оценки тяжести стрептококковых поражений кожи являются сывороточные уровни а-АТ и АИАТ к ФНО При проведении анализа следует учитывать, что наличие различных сопутствующих заболеваний, в том числе инфекционных, эндокринных, может влиять на исследуемые параметры, что может привести к неточной интерпретации исследуемых показателей. ПРИМЕРЫ Пример 1 Пациент К., 36 лет. Болен в течение 3 лет. Весной и осенью появляются 3-5 фликтенелезных элемента на туловище на фоне субфебрильной температуры. Диагноз: стрептодермия. Результаты тестирования: Уровень а-АТ к ФНО Заключение: течение заболевания легкое. Пример 2 Пациент З., 32 лет. В пахово-бедренных областях и межъягодичной складке большое количество сливающихся фликтен, которые быстро вскрываются, образуя сплошные эрозированные мокнущие поверхности ярко-розового цвета, с фестончатыми краями и бордюром отслаивающегося эпидермиса. Болен в течение 7 лет. Диагноз – гидраденит (стафилодермия). Результаты тестирования: Уровень а-АТ к ФНО Заключение: течение заболевания средней тяжести. Пример 3 Больной Ф., 39 лет. Болен в течение 4 лет. Заболевание началось с перифолли-кулярной пустулы с серозно-гнойным содержимым, быстро ссыхающимся в выпуклую корочку золотисто-желтого цвета. После ее отпадения обнаруживалась язва овальной формы с кровоточащим дном, покрытым грязно-серым налетом и мягкими отечными застойно-гиперемированными краями. Через 2-3 недели язва медленно заживала поверхностным рубцом, вокруг которого располагалась зона гиперпигментации. Процесс локализовался на голенях и коже бедер. Результаты тестирования: Уровень а-АТ к ФНО Заключение: тяжелое течение заболевания. ТЕХНИКО-ЭКОНОМИЧЕСКАЯ И СОЦИАЛЬНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Применение диагностической тест-системы, с помощью которой определяют сывороточный уровень идиотипических и антиидиотипических антител к ФНО Исследование проводится в лаборатории для иммуноферментного анализа.
Формула изобретения
Способ оценки тяжести течения стрептодермий, включающий забор крови, проведение клинико-биохимического исследования, отличающийся тем, что с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) определяют сывороточные уровни идиотипических и антиидиотипических антител к ФНО
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 07.04.2006
Извещение опубликовано: 27.04.2007 БИ: 12/2007
MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 07.04.2006
Извещение опубликовано: 20.06.2007 БИ: 17/2007
|
||||||||||||||||||||||||||
(вместо F(ab)2-фрагментов АИАТ к ФНО
). Их активность связана с интенсивностью течения воспалительного процесса. Что касается факторов, влияющих на их активность, то особый интерес может представлять изучение сывороточного содержания аутоантител (а-АТ) к данным цитокинам (идиотипов) и соответствующих антиидиотипических антител (АИАТ), т.е. антител, специфически связывающих вариабельные участки данных а-АТ (приведенная терминология несколько условна, т.к., строго говоря, АИАТ тоже являются аутоантителами).