Патент на изобретение №2262534

(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ КОКСИЕЛЛОПОДОБНОГО МИКРООРГАНИЗМА “CENERENTOLA”

(57) Реферат:

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может найти применение в медицине. Для осуществления способа используют пару праймеров, специфических в отношении коксиеллоподобного микроорганизма “CENERENTOLA”. Использование данного способа позволяет определить коксиеллоподобный микроорганизм “CENERENTOLA” в клещах Haemaphysalis при наличии других микроорганизмов.

Изобретение относится к медицине, к эпидемиологии, к микробиологии и молекулярной биологии.

Аналогом является способ определения ДНК любого организма в исследуемом материале при наличии специфических для данного ДНК праймеров (Saiki R.M., Gelfand D.N., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. Science, 1988, 239: 487-491).

Недостатком является отсутствие специфических праймеров и модификаций основной методики для определения нового микроорганизма, что не позволяет диагностировать заражение биологических объектов (кровь, тканевая жидкость и другие биологические материалы больных людей и животных, а также клещей) коксиеллоподобным микроорганизмом “Cenerentola”. Указанный микроорганизм был обнаружен у клещей – переносчиков остролихорадочных заболеваний из группы пятнистых лихорадок. Этому микроорганизму авторами было дано временное название “Cenerentola”.

Наиболее близким аналогом-прототипом является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики близкого микроорганизма – возбудителя гранулоцитарного эрлихиоза человека (Massung R.F., Slater К., Owens J.H. et al. Nested PCR assay for detection of granulocytic ehriichiae. J.Clin Microbiol., 1998, 36: 1090-1095.), который также не позволяет определить наличие в исследуемом материале ДНК микроорганизма “Cenerentola”.

Задачей изобретения является обнаружение нового микроорганизма “Cenerentola” в биологических средах путем определения ДНК с помощью ПЦР.

Способ осуществляется следующим образом: выделение ДНК микроорганизма “Cenerentola” из любого исследуемого материала проводят методом Ausubel F.M., Brent R., Kingaton R.E. et al. (Short Protocols in Molecular Biology. – New York: John Wiley & Sons, 1999), для проведения ПЦР используют пару праймеров, подобранных на основе секвенирования гена 16S рибосомальной РНК микроорганизма “Cenerentola”, со специфической последовательностью нуклеотидов:

Cox1 (5′-CAGAGAGTGCAAGCGTTAATC) и

Соx2 (5′-CTCCTTAGAGTTCCCGGCCAACCG)

с оптимизацией условий проведения реакции: 1 1 исследуемой очищенной ДНК добавляется к 9, 19 или 49 1 реакционной смеси, содержащей соответствующее количество необходимых компонентов для проведения ПЦР с Taq-полимеразой (производства Promega, USA). Начальная денатурация – 7 минут, затем 40 циклов, состоящих из 30 секунд денатурации при 94°С, 30 секунд присоединения праймеров при 50°С и 30 секунд элонгации при 72°С. Финальная элонгация продолжается 7 минут при 72°С. В результате проведенной реакции при наличии в образце, взятом для исследования, хотя бы нескольких молекул ДНК искомого микроорганизма, происходит репликация ДНК до количеств, определяемых лабораторными методами.

Пример. 20 клещей вида Haemaphysalis concinnae были исследованы на наличие микроорганизма “Cenerentola”. До момента исследования клещи хранились при – 80°С. ДНК извлекалась при помощи коммерческих наборов фирмы Qiagen. При проведении ПЦР по вышеописанной методике во всех 20 пробах был получен положительный результат. Проведенное далее прямое секвенирование полученного фрагмента ДНК показало, что все полученные ампликоны принадлежат одному и тому же микроорганизму, которому ранее авторами было дано временное название коксиеллоподобный микроорганизм “Cenerentola” (Coxiella-like microorganism “Cenerentola”). Одновременно с проводимыми исследованиями проводились реакции с выделенными ДНК от следующих микроорганизмов: Rickettsia sibirica, Anaplasma phagocytophila, Anaplasma bovis, Ehriichia chaffeensis, Borrelia burgdorferi sensu stricto. Ни в одной из исследуемых проб не было получено положительного результата. Кроме того, предшествующие исследования показали, что клещи Haemaphysalis concinnae содержат в себе не только ДНК коксиеллоподобного микроорганизма “Cenerentola”, но одновременно и ДНК других микроорганизмов, таких как Anaplasma bovis, Agrobacterium tumefaciens, Stenotrophomonas maltophila, микроорганизм “Montezuma”; при проведении ПЦР по указанной методике ДНК ни одного из вышеуказанных микроорганизмов не вступала в реакцию с праймерами, что было доказано при секвенировании полученных при ПЦР ампликонов. Специфичность предлагаемых для ПЦР праймеров была проверена при поиске гомологии в базах данных GenBank и DDBJ (DNA Database of Japan).

Предлагаемый способ был оценен при исследовании ДНК, выделенной из клещей (переносчиков или естественных хозяев микроорганизма). Достоверность результатов была проверена прямым секвенированием полученного фрагмента ДНК и сравнения его с эталонной ДНК искомого микроорганизма “Cenerentola” (последовательность зарегистрирована под номером AF521888 в международном банке генетических данных GenBank).

Формула изобретения

Способ определения коксиеллоподобного микроорганизма, характеризующийся тем, что определяют наличие у коксиеллоподобного микроорганизма ДНК с помощью ПНР с использованием пары праймеров

Cox1 (5′-CAGAGAGTGCAAGCGTTAATC) и

Cox2 (5′-CTCCTTAGAGTTCCCGGCCAACCG),

с соблюдением следующих условий: 11 исследуемой очищенной ДНК добавляется к 9, 19 или 49 1 реакционной смеси, содержащей соответствующее количество необходимых компонентов для проведения ПЦР с Taq-полимеразой, начальная денатурация 7 мин, затем 40 циклов, состоящих из 30 с денатурации при 94°С, 30 с присоединения праймеров при 50°С и 30 с элонгации при 72°С, финальная элонгация продолжается 7 мин при 72°С.

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 20.11.2005

Извещение опубликовано: 27.04.2007 БИ: 12/2007

MM4A – Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 20.11.2005

Извещение опубликовано: 20.06.2007 БИ: 17/2007