Патент на изобретение №2262531

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS RUBER – ДЕСТРУКТОР ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке окружающей среды. Предлагается штамм бактерий, относящийся к виду Rhodococcus ruber, обладающий высокой разрушающей активностью в отношении полихлорированных бифенилов. Штамм депонирован в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН с коллекционным номером ИЭГМ 896. Штамм отличается способностью эффективно расти на 2-, 4-, и 2,4′-хлорбифенилах и продуктах метаболизма полихлорбифенилов – 2-, 4- и 2,4-хлорбензойных кислотах. В процессе роста разлагает 2,2′-, 4,4′-дихлорбифенилы, 2,4,2′-, 2,4,4′-трихлорбифенилы. Штамм может быть выращен промышленным способом с использованием стандартного оборудования с применением доступного сырья. Изобретение может служить основой для получения биопрепаратов для очистки почв, содержащих высокие концентрации полихлорированных бифенилов. 2 ил., 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке окружающей среды от загрязнения полихлорированными бифенилами (ПХБ) при помощи микроорганизмов, и касается получения нового штамма бактерий, способного эффективно разлагать ПХБ. Полихлорированные бифенилы относятся к ряду распространенных загрязнителей, являются токсичными и устойчивыми соединениями, которые аккумулируются в почве, донных отложениях. Эффективным способом очистки почв и водоемов от ПХБ является биоремедиация с помощью микроорганизмов. Однако большинство изученных и описанных в научной литературе микроорганизмов трансформируют ПХБ только до хлорбензойных кислот (ХБК), которые также являются токсичными и устойчивыми соединениями (Unterman R., в книге под ред. Crawford R.L., Crawford D.L.: Bioremediation. Principles and Applications, 1996, pp.209-253).

Известно лишь несколько природных бактериальных штаммов, способных расти на монохлорбифенилах (2-, 3- и 4-хлорбифенилах), использующих такие соединения в качестве единственного источника углерода и энергии:

– Pseudomonas sp. MB86 растет на 4-хлорбифениле, разлагая 4-хлорбифенил до 4-хлорацетофенона (патент US №4,999,300);

– Pseudomonas cepacia P166 утилизирует монохлорбифенилы через хлоркатехолы, которые оказывают токсический эффект на рост штамма (Arensdorf, Focht, 1995, Appl. Environ. MicrobioL, 61:443-447).

В качестве прототипа нами выбран штамм Burkcholderia sp. SK-3, способный использовать в качестве ростового субстрата 4-хлорбифенил и 2,4′-дихлорбифенил (патент US №6,537,797). При росте на 4-хлорбифениле штамм Burkcholderia sp. SK-3 осуществляет частичную трансформацию данного хлорбифенила в 4-хлорбензойную кислоту, которая полностью утилизируется штаммом. Также штамм Burkholderia sp. SK-3 способен к слабому росту на 2,4′-дихлорбифениле при концентрации 0.27 mM.

Цель изобретения – получение штамма бактерий, способного осуществлять эффективное разложение полихлорированных бифенилов до продуктов основного обмена микробной клетки.

Сущность изобретения: получение нового штамма бактерий, способного эффективно расти на 2-, 4- и 2,4′-хлорбифенилах и продуктах метаболизма полихлорбифенилов – 2-, 4- и 2,4-хлорбензойных кислотах, используя данные соединений в качестве единственного источника углерода и энергии.

Штамм выделен из почвы, загрязненной отходами химического производства, выпускающего широкий ассортимент галогенсодержащих органических соединений. Выделение штамма осуществлялось общепринятыми методами (методом накопительных культур и методом выделения чистых культур микроорганизмов) на минеральной среде К1 (Зайцев Г.М., Карасевич Ю.Н., 1981, Микробиология, 50:35-40) с использованием бифенила в качестве единственного источника углерода и энергии.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими и хемотаксономическими признаками.

При росте на агаризованной среде штамм образует круглые колонии с блестящей поверхностью оранжево-красного цвета на полноценной среде и розово-оранжевого цвета на минеральных средах.

Клетки грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, аэробные, имеют цикл развития: клетки культур 16-20 часового возраста длинные (0.8-1.2×16-19 мкм), обильно ветвящиеся, к 28-30 часам роста отмечено фрагментирование нитей, культуры 48-64 часового возраста представлены кокковидными овальными клетками (длиной 1-4 мкм).

Биохимические свойства штамма представлены в таблице 1.

Штамм растет на этаноле, моноэтаноламине, но не на L-аспарагине. Образует кислоту при росте на большинстве углеводов, многоатомных спиртов (таблица 2).

Штамм усваивает Na-соли уксусной, пропионовой, бутановой, пировиноградной, бензойной кислот, но не растет на Na-солях винной, муравьиной, -кетоглутаровой кислот.

Клеточная стенка содержит липид LCN-A типа Rhodococcus ruber. Основная аминокислота клеточной стенки – мезо-ДАПК (мезодиаминопимеленовая кислота), сахара клеточной стенки – арабиноза, галактоза.

Чувствительность к антибактериальным препаратам.

Штамм чувствителен к неомицину, стрептомицину, ристомицину, левомицетину.

Патогенность: штамм не патогенный.

На основании перечисленных характеристик штамм отнесен к виду Rhodococcus ruber. Штамм депонирован в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН под названием Rhodococcus ruber с коллекционным номером ИЭГМ 896.

Изобретение может быть использовано в очистке объектов окружающей среды (почв, отвалов, донных отложений, захоронений отходов промышленных предприятий) от загрязнения полихлорированными бифенилами и хлорированными бензойными кислотами.

Культура используемого в данном изобретении штамма бактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 896 может быть выращена на простых микробиологических средах, включающих различные источники углерода, азота, органические и неорганические соли, которые обычно используются для получения биомассы бактерий.

Деградативные активности в отношении полихлорированных бифенилов штамма проверяли путем анализа ростовых характеристик при выращивании штамма на индивидуальных хлорбифенилах и хлорбензоатах, а также в опытах с «отмытыми» клетками путем обнаружения продуктов метаболизма ПХБ (методом спектрофотометрии и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии).

Пример 1. Кинетику роста штамма изучали в периодической культуре при выращивании в жидкой минеральной среде следующего состава: К₂HPO₄×3Н₂О – 4 г/л, NaH₂PO₄×2Н₂О – 0.4 г/л, (NH₄)₂SO₄ – 0.5 г/л, Са(NO₃)₂ – 0.01 г/л, MgSO₄×7Н₂О – 0.15 г/л, NaMoO₄×2Н₂О – 4.0 г/л (рН среды – 7.3), на бифениле, хлорбифенилах и 2-, 4-, 2,4-хлорбензоатах, которые использовались в качестве единственного источника углерода и энергии. Культивирование проводили в колбах на 250 мл (объем среды – 100 мл) при 28°С, аэрация на шейкере при 100 об/мин. Бифенил вносили в виде порошка (1 г/л), а хлорбифенилы и хлорбензоаты – в виде растворов до конечной концентрации 0.5 г/л и 1 г/л, соответственно. В качестве инокулята использовали культуру, выращенную на минеральной среде (состав среды смотри выше) с бифенилом или с соответствующей хлорбензойной кислотой. Начальная концентрация бактерий в колбах составляла 4-5×10⁴ кл/мл. Оптическую плотность (ОД) определяли фотометрически при длине волны 540 нм. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли методом стандартных серийных разведений с последующим высевом и подсчетом колоний микроорганизмов на чашках с агаризованной средой LB (5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л триптона, 10 г/л хлорида натрия, 15 г/л агара Difco).

Штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 896 способен использовать в качестве единственного источника углерода и энергии 2-, 4- и 2,4′-хлорбифенилы, а также продукты метаболизма данных хлорбифенилов -2- и 4-хлорбензоаты. В процессе роста на 2- и 4-хлорбензоатах в среде отмечено накопление эквимолярного количества свободных ионов хлора и снижение концентрации субстрата, что свидетельствует об отсутствии токсичных метаболитов. Рост штамма на данных соединениях представлен на фиг. 1 и 2.

Таким образом, штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 896 способен полностью утилизировать 2-, 4- и 2,4′-хлорбифенилы в концентрации 0.5 г/л (0.5 г/л 2,4′-диХБ соответствует 2.25 mM данного хлорбифенила) и является более активным деструктором, чем штамм Burkholderia sp. SK-3.

Пример 2. Продукты деградации хлорбифенилов определяли спектрофотометрически и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Штаммы выращивали в жидкой минеральной среде (состав среды: К₂HPO₄×3Н₂O – 4 г/л, NaH₂PO₄×2H₂O – 0.4 г/л, (NH₄)₂SO₄ – 0.5 г/л, Ca(NO₃)₂ – 0.01 г/л, MgSO₄×7Н₂O – 0.15 г/л, NaMoO₄×2H₂O – 4.0 г/л, рН среды – 7.3) с бифенилом (1 г/л) при 28°С до ОД₆₀₀=1.0. Отмытые клетки (1 мл, ОД₆₀₀=2.0) переносили во флаконы с тефлоновыми крышками. Монохлорбифенилы добавляли до конечной концентрации 500 мкМ (94.25 мг/л), дихлорбифенилы – 100 мкМ (22.3 мг/л), трихлорбифенилы – 50 мкМ (12.8 мг/л). Флаконы встряхивали на шейкере при температуре 28°С и 100 об/мин. Образование продукта мета-расщепления хлорбифенилов (2-гидрокси-6-оксо-6-фенилгексадиеновой кислоты) определяли спектрофотометрически при _max от 390 нм до 450 нм. Содержание хлорбензоатов в среде культивирования регистрировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Идентификацию продуктов метаболизма проводили при сравнении «времени выхода» пиков образовавшихся соединений со стандартами. В качестве стандартов использовались растворы 2ХБК, 4ХБК, 2,4ДХБК в концентрациях 1 г/л, 100 мкМ, 20 мкМ.

Динамику дегалогенирования хлорбифенилов определяли измерением оптической плотности раствора хлорида серебра, образующегося после реакции ионов хлора с азотнокислым серебром, при 460 нм и 540 нм в культуральной жидкости, освобожденной от клеток.

Штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 896 осуществляет деструкцию различных орто- и пара-хлорированных бифенилов, в том числе 2,2′-, 4,4′-дихлорбифенилов, 2,4,2′- и 2,4,4′-трихлорбифенилов. Данные по деструкции ПХБ приведены в таблице 3.

Таблица 3 Деструкция хлорбифенилов штаммом Rhodococcus ruber ИЭГМ 896
ПХБ	Концентрация ПХБ (мг/л)	Время инкубации (час)	Концентрация ионов хлора (мг/л)	Хлорбензойная кислота			ГОФДК
				Положение хлора	Концентрация		max	ОД
					мг/л	%*
2-моно-ХБ	94.25	0	н.о.	2	–	–	395	0.13±0.02
		5			26.61±0.2	34.0		0.69±0.03
		24			60.25±0.4	77.0		0.25±0.01
4-моно ХБ	94.25	0	н.о.	4	1.09±0.02	1.4	434	0.05±0.01
		5			51.65±0.1	66.0		0.52±0.02
		24			32.08±0.08	41.0		0.57±0.04
2,2′-диХБ	22.3	0	–	2	–	–	–	–
		24	4.3±0.2		2.22±0.07	14.2		–
		48	7.8±0.2		н.о.	н.о.		–
2,4′-диХБ	22.3	0	–	4	–	–	397	<0.1
		24	4.6±0.5		5.77±0.03	36.9		0.52±0.07
		48	6.8±0.3		1.05±0.02	6.77		0.39±0.03
4,4′-диХБ	22.3	0	–	4	–	–	434	0.06±0.01
		24	2.8±0.3		10.64±0.04	68.0		0.38±0.02
		48	7.010.2		1.88±0.02	12.0		0.411±0.07
2,4,2′-три-ХБ	12.8	0	0	2	–	–	–	–
		5	<2.0		0.79±0.01	10.2		–
		24	2.2±0.3		2.91±0.02	37.4		–
2,4,4′-триХБ	12.8	0	0	2,4	–	–	396	0.1
		5	<2.0		4.75±0.04	49.9		0.82±0.03
		24	<2.0		5.55±0.03	58.5		0.71±0.02
Примечание: н.о. – не определяли, “-” – не зафиксировано, *% от теоретически возможного.

Таким образом, штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 896 может служить основой для получения биопрепаратов для очистки почв и водоемов, содержащих высокие концентрации полихлорированных бифенилов и хлорбензойных кислот.

Формула изобретения

Штамм бактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 896 – деструктор полихлорированных бифенилов.

РИСУНКИ