Патент на изобретение №2261911

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОКАТАЛИЗАТОРА И БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов, может быть использовано для удаления фосфорорганических соединений (ФОС) с различных поверхностей, в том числе кожных покровов, и последующей их детоксикации, а также для применения в качестве эффективных средств индивидуальной защиты. Для получения биокатализатора нерастворимый пористый материал вносят в раствор полимера, представляющего собой аминополисахарид, с одновременным внесением в тот же раствор белка и глутарового альдегида с последующим отжимом формирующейся ферментсодержащей композиции и ее последовательной обработкой растворами боргидрида натрия и антимикробных веществ. Изобретение позволяет получать в ходе непродолжительного процесса биокатализатор с концентрацией иммобилизованного белка до 25,0 мг/г биокатализатора и высокой каталитической активностью до 950 ед/г биокатализатора по отношению к ряду ФОС. 2 н.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл.

(56) (продолжение):

CLASS=”b560m”v.32, n.10, p.2254-2258. US 6642037, 04.11.2003. CALDWELL S.R., RAUSHEL P.M. Detoxification of organophosphate pesticides, using a naylon based Immobilized phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. Appl. Biochem. Biotechnol. 1991, v.37, p.59-72. ЕФРЕМЕНКО E.H., СЕРГЕЕВА B.C. Органофосфатгидролаза – фермент, катализирующий деградацию фосфорсодержащих отравляющих веществ и пестицидов. Известия АН. Сер. “Хим”. 2001, с.1743-1749.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов, может быть использовано для удаления фосфорорганических соединений (ФОС) с различных поверхностей, в том числе кожных покровов, и последующей их детоксикации, а также для применения в качестве эффективных средств индивидуальной защиты.

Растворимая форма ОРН подвержена влиянию многих факторов, приводящих к необратимой инактивации фермента, и вследствие этого является нестабильной. Для получения стабильной формы ОРН, способной осуществлять гидролиз ФОС, проводят ее иммобилизацию различными способами.

Одной из главных характеристик любого способа получения биокатализатора на основе иммобилизованного фермента является максимальное количество белка, которое может быть иммобилизовано на единице носителя (на 1 г, мл, см², см³).

Основной характеристикой любого биокатализатора, полученного на основе иммобилизованного фермента, является каталитическая активность, локализованная на единице носителя (на 1 г, мл, см², см³).

За единицу ферментативной активности принимают количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоль субстрата за одну минуту при 25°С и рН 9,0. Сравнение ферментативной активности разных биокатализаторов проводится по параоксону как самому широко распространенному субстрату.

Каталитическая эффективность действия фермента, представляющая собой отношение максимальной скорости ферментативной реакции (V_max) к константе Михаэлиса (Km), отражающей степень сродства субстрата к ферменту, используется для сравнения каталитических свойств иммобилизованной и нативной форм фермента. Изменение величины каталитической эффективности действия фермента отражает влияние способа получения иммобилизованного фермента на его каталитические свойства.

Эти основные характеристики способов получения биокатализаторов и самих биокатализаторов используются для их сравнительного анализа.

Большая продолжительность процесса иммобилизации, низкая активность биокатализаторов и механическая прочность легко разрушаемого носителя являются существенными недостатками способа получения биокатализаторов и самих биокатализаторов, применение которых возможно только в биосенсорных системах для гидролиза ФОС в жидкой среде.

Основным недостатком способа является крайне низкое количество иммобилизованного белка и, как следствие, очень низкая активность биокатализатора. Форма и физические свойства биокатализатора не позволяют использовать его для удаления ФОС с поверхностей, а только для проведения гидролиза ФОС в жидкой среде.

Существенными недостатками способа получения биокатализатора являются: необходимость использования больших количеств дорогостоящего полиэлектролита (полибрена) для получения активного биокатализатора с иммобилизованным ферментом, стабилизированным полиэлектролитным комплексом, и достаточно низкие концентрации белка, вводимые в носитель и определяющие конечную активность биокатализатора. Форма и физические свойства биокатализатора не позволяют использовать его для удаления ФОС с поверхностей, а только для проведения гидролиза ФОС в жидкой среде.

Известен способ получения биокатализатора на основе нейлона, содержащего иммобилизованную ОРН [Caldwell, S.R., Raushel, F.M. Detoxification of organophosphate pesticides using a naylon based Immobilized phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta.ll Appl. Biochem. Blotechnol., 1991, V.37, p.59-72]. Способ позволяет получать биокатализатор в форме трубки, мембраны или в виде мелкодисперсного порошка с поверхностью, содержащей иммобилизованный белок. Для иммобилизации частично очищенного фермента проводят активацию поверхности носителя, которую обрабатывают 12,5% раствором глутарового альдегида при 4°С в течение 2 ч, далее носитель выдерживают в контакте с раствором фермента при 4°С в течение 2 ч и промывают 0,1 М раствором бората натрия. Биокатализатор, выполненный в виде трубки, мембраны и порошка, имеет активность соответственно 72 ед/см³, 12,6 ед/см² и 360 ед/г носителя. Общее время получения биокатализатора составляет 4 ч. Каталитическая эффективность действия фермента снижается в 160 раз в результате иммобилизации по сравнению с растворимой формой.

Необходимость проведения всего процесса иммобилизации фермента при низкотемпературных условиях и значительные потери активности ферментом в результате его иммобилизации являются явными недостатками способа получения биокатализатора и самого биокатализатора.

Одним из недостатков данного биокатализатора является краткосрочность его возможного использования, а именно не более 2 ч в проточной системе при скорости протока до 45 мл/ч, способ предполагает проведение повторной иммобилизации новой порции фермента на том же носителе. Высокий расход фермента для регенерации и получения активного биокатализатора, а также достаточно высокая стоимость тритил-агарозы являются экономическими ограничениями этого способа получения биокатализатора. Большим недостатком биокатализаторов является высокое сродство ФОС (параоксон, малатион, диизопропилфторфосфат и кумафос), являющихся субстратами для фермента, к матрице носителя, что приводит к активной их сорбции на самом носителе, вместо ферментативного гидролиза. Способ получения биокатализатора также не позволяет получить в достаточной степени стабилизированный фермент, о чем свидетельствует его быстрая инактивация под действием различных факторов, в частности, в присутствии 1% органического растворителя. Форма и физические свойства биокатализатора не позволяют использовать его для удаления ФОС с поверхностей, а только для проведения гидролиза ФОС в жидкой среде.

Известен способ получения биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН, предполагающий применение пенополиуретановой пены или губки в качестве носителя [Patent US 6642037, 2003; Preparation of enzymatically active sponges or foams for detoxification of hazardous compounds, C 12 N 11/04, C 12 N 11/08, C 12 S 9/00, C 12 S 13/00]. Готовый биокатализатор может содержать набор иммобилизованных ферментов, таких как ацетилхолинэстераза, бутирилхолинэстераза, органофосфатгидролаза и др. и предназначен для детоксикации ФОС. Способ получения биокатализатора заключается в приготовлении смеси (при весовом соотношении 1:1) двух фаз: водной фазы, состоящей из 1-2% раствора поверхностно-активного вещества (плюроник Р-65, Р-85 или L-62), приготовленного на основе 50 мМ фосфатного буфера (рН 8,0), и раствора высокоочищенного фермента, смешанных между собой в соотношении 10:1 по объему, и гидрофобной фазы, представляющей собой полиуретановый преполимер Hypol TDI 3000 или Hypol Plus FHP-5000 (толил-диизоцианат). Образующуюся двухфазную систему интенсивно перемешивают (2500 об/мин), взбивая в пену в течение 0,5-1 мин, и оставляют для формирования ферментсодержащей полимерной композиции (биокатализатора) в течение 10 мин. Полученный материал тщательно промывают 50 мМ фосфатным буфером (рН 8,0), высушивают (в течение 6 ч) и хранят в запаянном виде при 4°С. Общее время получения биокатализатора без учета периода сушки составляет 20-25 мин.

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по способу получения биокатализатора на основе ОРН, иммобилизованной в составе полимерной композиции, и по предназначению получаемого биокатализатора, принято за прототип.

Известное техническое решение имеет ряд существенных недостатков, главным из которых является получение биокатализатора с низкой концентрацией иммобилизованного белка и с низкой каталитической активностью.

Задачей предлагаемого изобретения является получение на основе иммобилизованной ОРН эффективного биокатализатора, предназначенного для удаления ФОС с различных поверхностей, в том числе кожных покровов, и последующей их детоксикации.

Поставленная задача решается тем, что нерастворимый пористый материал вносят в раствор полимера, представляющего собой аминополисахарид, с одновременным внесением в тот же раствор белка и глутарового альдегида с последующим отжимом формирующейся ферментсодержащей композиции и ее последовательной обработкой растворами боргидрида натрия и антимикробных веществ.

Использование тканых и нетканых материалов на основе хлопка (бязь, марля, войлок и др.) в качестве нерастворимого пористого материала обусловлено тем, что они, во-первых, материалы на основе хлопка, в отличие от синтетических, обладают высокой сорбционной емкостью и могут легко удерживать большие объемы гидрофильных жидкостей. Во-вторых, эти материалы производятся в больших объемах текстильной промышленностью и, следовательно, потенциальное производство биокатализатора на основе таких носителей может легко масштабироваться с использованием оборудования текстильных предприятий.

Использование нерастворимых пористых материалов, покрытых аминополисахаридными сшитыми гелями, существенно увеличивает их сорбционную емкость, и, таким образом, повышается эффективность удаления ФОС с различных поверхностей и удержания их, а также продуктов их детоксикации, в объеме биокатализатора.

Отжим формирующейся ферментсодержащей композиции применяется для удаления непрореагировавших компонентов реакционной системы.

Раствор боргидрида натрия применяется для восстановления образовавшихся азометиновых связей, что способствует химической стабильности и инертности структуры биокатализатора и, таким образом, устраняется риск какого-либо негативного воздействия биокатализатора на обрабатываемые поверхности.

Введение в состав биокатализатора с высокой влажностью (выше 50%) антимикробных веществ, применение которых допустимо, в том числе и в детской косметологии, создает благоприятные условия для длительного хранения биокатализатора в герметичном виде при отсутствии порчи готовой продукции и в состоянии полной готовности к применению, способствует предотвращению какой-либо угрозы возникновения у потребителей заболеваний кожи, связанных с микробным заражением, вызванным, например, культурами Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris и др., а также делает потенциально безопасным применение биокатализатора потребителем без каких-либо возрастных ограничений.

Заявляемый способ получения биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН осуществляется следующим образом: нерастворимый пористый носитель помещают в раствор полимера, представляющего собой аминополисахарид, с одновременным внесением в тот же раствор белка и глутарового альдегида с последующим отжимом формирующейся ферментсодержащей композиции и ее последовательной обработкой растворами боргидрида натрия и антимикробных веществ, так, что конечные концентрации компонентов в биокатализаторе составляют, мас.%: белок – до 2,5; аминополисахарид – 12,0-40,0; нерастворимый пористый носитель – 28,0-60,0; глутаровый альдегид – 0,01-0,10; антимикробные вещества – до 3,0; вода – остальное до 100%.

Общее время получения биокатализатора составляет не более 20 мин, способ позволяет получать биокатализатор, содержащий до 25,2 мг белка на 1 г биокатализатора.

Вторым объектом изобретения является биокатализатор на основе иммобилизованной органофосфатгидролазы для детоксикации ФОС, полученный по этому способу, который имеет активность до 950 ед/г биокатализатора.

Существенным техническим результатом заявляемого изобретения является высокая концентрация иммобилизованного белка в расчете на 1 г биокатализатора и высокая каталитическая активность биокатализатора. Непродолжительность процесса получения биокатализатора обеспечивает минимальное инактивирующее воздействие условий иммобилизации на каталитическую активность фермента. Способ получения биокатализатора значительно стабилизирует фермент и позволяет хранить препарат иммобилизованного фермента при 23°С в течение, как минимум, двух месяцев.

Биокатализатор имеет макропористую структуру, обеспечивающую высокую влагоемкость, а именно присутствие аминополисахаридных гелей в структуре биокатализатора дает возможность дополнительного 3,5-4,5-кратного увеличения массы сорбируемой влаги к известному высокому (8-10-кратному) уровню влагоудержания натуральных волокнистых материалов, также используемых при получении биокатализатора. Иммобилизованный фермент сохраняет все свои каталитические характеристики, известные для нативного аналога.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Получение биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН при использовании тканого целлюлозного материала (бязи) в качестве нерастворимого носителя, сульфата хитозана как аминополисахарида и пропилпарабена как антимикробного вещества.

Тканый целлюлозный материал (бязь) (52 г) помещают в 8%-ный раствор сульфата хитозана (191 г) с одновременным внесением в тот же раствор 280 мл раствора ОРН (8 мг/мл, 250 ед/мг) и 280 мл 10%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее последовательную обработку растворами боргидрида натрия и 100 мМ глициновым буфером, содержащим 5,26 г пропилпарабена, так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок – 1,84, сульфат хитозана – 12,61, нерастворимый пористый носитель – 47,95, глутаровый альдегид – 0,023, антимикробное вещество – 3,0, вода – остальное до 100%. Общее время получения биокатализатора составляет 20 мин. Способ позволяет ввести 18,4 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 905 ед/г биокатализатора.

Пример 2. Получение биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН при использовании тканого целлюлозного материала (марли) в качестве нерастворимого носителя и хитозана как аминополисахарида.

Тканый целлюлозный материал (марлю) (30,5 г) помещают в 2%-ный раствор хитозана (376 г) с одновременным внесением в тот же раствор 80 мл раствора ОРН (20 мг/мл, 190 ед/мг) и 160 мл 20%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее обработку раствором боргидрида натрия так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок – 2,36, хитозан – 13,52, нерастворимый носитель – 60,04, глутаровый альдегид – 0,051, вода – остальное до 100%. Общее время получения биокатализатора составляет 15 мин. Способ позволяет ввести 23,6 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 650 ед/г биокатализатора.

Пример 3. Получение биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН при использовании войлока в качестве нерастворимого носителя, карбоксиметил хитозана как аминополисахарида и катона CG как антимикробного вещества.

Войлок (16 г) помещают в 3%-ный раствор карбоксиметил хитозана (275 г) с одновременным внесением в тот же раствор 25 мл раствора ОРН (4 мг/мл, 400 ед/мг) и 85 мл 5%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее последовательную обработку раствором боргидрида натрия и 100 мМ глициновым буфером, содержащим 2,5 г катона CG, так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок – 0,17, карбоксиметил хитозан – 20,7, нерастворимый носитель – 44,78, глутаровый альдегид – 0,011, антимикробное вещество – 2,24, вода – остальное до 100%. Общее время получения биокатализатора составляет 15 мин. Способ позволяет ввести 17 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 475 ед/г биокатализатора.

Пример 4. Получение биокатализатора при использовании для иммобилизации ОРН нетканого целлюлозного материала в качестве нерастворимого носителя, сульфата хитозана в качестве аминополисахарида и хлорида бензетония в качестве антимикробного вещества.

Нетканый целлюлозный материал (15,5 г) помещают в 5%-ный раствор сульфата хитозана (480 г) с одновременным внесением в тот же раствор 50 мл раствора ОРН (32 мг/мл, 200 ед/мг) и 160 мл 50%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее последовательную обработку растворами боргидрида натрия и 100 мМ глицинового буфера, содержащего 3,0 г хлорида бензетония, так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок – 2,52, сульфат хитозана – 40,36, нерастворимый пористый носитель – 27,88, глутаровый альдегид – 0,108, антимикробное вещество – 1,08, вода – остальное до 100%. Общее время получения биокатализатора составляет 20 мин. Способ позволяет ввести 25,2 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 880 ед/г биокатализатора.

Пример 5. Получение биокатализатора при использовании льна в качестве нерастворимого носителя, сульфата хитозана в качестве аминополисахарида и метилпарабена в качестве антимикробного вещества.

Тканый целлюлозный материал (лен) (25 г) помещают в 9%-ный раствор сульфата хитозана (185 г) с одновременным внесением в тот же раствор 45 мл раствора гексагистидиновой ОРН (26 мг/мл, 180 ед/мг) и 165 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида. Далее отжимают формирующуюся ферментсодержащую композицию на плюсовочном аппарате и проводят ее последовательную обработку растворами боргидрида натрия и 100 мМ глицинового буфера, содержащего 1,3 г метилпарабена, так, что полученный биокатализатор имеет следующий состав, мас.%: белок – 2,25, сульфат хитозана – 26,36, нерастворимый пористый носитель – 48,18, глутаровый альдегид – 0,053, антимикробное вещество – 1,35, вода – остальное до 100%. Общее время получения составляет 20 мин. Способ позволяет ввести 22,5 мг белка/г биокатализатора. Препарат имеет активность, равную 950 ед/г биокатализатора.

Пример 6. Свойства биокатализатора, полученного согласно заявляемому способу.

Биокатализатор, полученный, как описано в Примере 1, имеет активность, равную 905 ед/г, и каталитические характеристики (константу Михаэлиса, V_max, каталитическую эффективность действия фермента), представленные в таблице (таблица приведена в конце описания).

На Фиг.1 представлены рН-зависимости каталитической активности биокатализатора и растворимого фермента. Снижение каталитической эффективности действия иммобилизованного фермента по отношению к растворимому не более чем в 3 раза свидетельствует о том, что биокатализатор способен осуществлять, как и растворимый фермент, высокоэффективный гидролиз различных ФОС.

На Фиг.2 и 3 показана стабильность при хранении при 4°С и 23°С соответственно биокатализаторов, полученных с введением в их состав антимикробных веществ, как описано в Примерах 1, 2, 4 и 5.

На Фиг.4 и 5 приведены электронные микрофотографии биокатализаторов, полученных, как описано в Примерах 1 и 4 соответственно. На Фиг.6-8 приведены электронные микрофотографии аминополисахаридных гелей, формирующихся при получении биокатализаторов, согласно Примерам 1, 4 и 5 соответственно, которые подтверждают наличие у них макропористой структуры, не создающей диффузионных затруднений для процессов, катализируемых иммобилизованным ферментом.

На Фиг.9 приведены данные по способности аминополисахаридных гелей, формирующихся при получении биокатализаторов согласно Примерам 1 и 4, сорбировать влагу. Наличие в составе биокатализатора аминополисахаридного геля дает возможность дополнительного 3,5-4,5-кратного увеличения массы сорбируемой влаги к известному (8-10-кратному) уровню сорбционной способности натуральных волокнистых материалов, используемых при получении предлагаемого биокатализатора с его исходной 50-60% влажностью.

Таким образом, предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом обладает рядом преимуществ:

– Способ получения биокатализатора позволяет увеличить удельную концентрацию иммобилизованного белка на единице носителя (мг/г) в 3,4-5 раз (Примеры 1, 2, 4, 5);

– Биокатализатор, полученный согласно заявляемому способу, имеет каталитическую активность в 36,5-73 раза выше по сравнению с прототипом (Примеры 1-5);

– Применение разнообразных тканых и нетканых материалов (бязь, марля, войлок и др.) (Примеры 1-5) в качестве нерастворимого пористого носителя позволяет варьировать геометрические размеры и формы биокатализатора и, таким образом, существенно расширяет возможность применения биокатализатора;

– Введение антимикробных веществ в состав биоктализатора позволяет длительно хранить его во влажном состоянии (Пример 6), не подвергая биокатализатор высушиванию, которое требуется для прототипа. Таким образом, для получения готовой формы биокатализатора не требуется проведения дополнительной достаточно длительной и дорогостоящей технологической стадии, как сушка;

– Биокатализатор, полученный на основе натуральных волокон и аминополисахаридных гелей, потенциально обладает более высокой гигроскопичностью по сравнению с синтетическим носителем (Пример 6);

– Способ получения биокатализатора в отличие от прототипа не предполагает использование ацетил- и бутирилхолинэстераз в комбинации с ОРН, что исключает необходимость проведения регенерации холинэстераз, инактивированных при взаимодействии с ФОС, после каждого рабочего цикла биокатализатора.

Формула изобретения

1. Способ получения биокатализатора на основе иммобилизованной органофосфатгидролазы для детоксикации фосфорорганических соединений, характеризующийся тем, что нерастворимый пористый материал помещают в раствор полимера, представляющего собой аминополисахарид, с одновременным внесением в тот же раствор белка и глутарового альдегида с последующим отжимом формирующейся ферментсодержащей композиции и ее последовательной обработкой растворами боргидрида натрия и антимикробных веществ так, что конечные концентрации компонентов в биокатализаторе составляют, мас.%:

2. Биокатализатор на основе иммобилизованной органофосфатгидролазы для детоксикации фосфорорганических соединений, характеризующийся тем, что он получен по способу по п.1, содержит до 25,0 мг иммобилизованного белка/г биокатализатора и обладает каталитической активностью до 950 ед./г биокатализатора.

РИСУНКИ